杜仲葉中綠原酸的提取分離及結構鑒定

楊秀芳，汪洋，馬養民

（陜西科技大學教育部輕化工助劑化學與技術重點實驗室，陜西西安 710021）

杜仲（Eucommia ulmoides Olive）為杜仲科杜仲屬植物，僅一屬一種。杜仲在我國研究和利用已有兩千多年的歷史[1]。傳統中醫以皮入藥，但樹皮生長緩慢，種植10年～20年后才能剝皮，每年杜仲皮的增長量僅為0.4 kg左右，緊缺的藥源無法滿足人類的需求[2]。為了保護和擴大藥源，杜仲以葉代皮研究日益活躍，研究發現杜仲葉與皮有著相似的藥理作用和化學成分，杜仲葉在臨床上也具有較好的療效[3]。杜仲屬于落葉喬木，杜仲葉具有廉價、采摘方便、可循環再生等特點。這為杜仲葉的進一步利用奠定了物質基礎，也為緩解緊缺的杜仲資源開辟了途徑[4]。

杜仲葉中富含活性化合物綠原酸，綠原酸又稱3－咖啡酰奎尼酸，是一種廣泛分布于植物體內的苯丙素類物質。經研究發現其具有抗菌、抗炎、保肝、利膽等多種功效，廣泛的應用于醫藥、食品、日用化工等行業，對綠原酸的提取純化為合理開發杜仲資源具有十分重要的意義[5]。本實驗通過對杜仲葉中綠原酸提取工藝和分離純化方法進行了研究，進一步為杜仲綜合利用提供參考。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器與設備

SENCO電熱恒溫浴鍋：上海申生科技有限公司；RE52CS－1旋轉蒸發器：鄭州南北儀器設備有限公司；Unic－2100型紫外可見光分光光度計：尤尼柯上海儀器有限公司；X－6精密顯微微量熔點測定儀：鞏義市予華儀器有限責任公司；Bruker avanceⅢ－400Hz超導核磁共振儀：瑞士布魯克公司。

1.2 材料與試劑

杜仲葉、皮均采自西北農林科技大學苗圃；綠原酸標準品：中國藥品生物制品檢驗所；D－101大孔吸附樹脂：山東魯抗醫藥股份有限公司；柱層析硅膠：青島海立信精細硅膠化工有限公司；薄層層析硅膠G：青島久隆盛業硅膠干燥劑有限公司；Sephadex LH－20：上海寶曼生物科技有限公司；甲醇、乙酸（色譜純）。

2 方法和結果

2.1 綠原酸水提工藝研究

2.1.1 綠原酸標準曲線的建立

準確稱取綠原酸標準品2.5 mg，甲醇溶解并定容至50 mL，得到綠原酸標準溶液（0.05 g/L）。分別從標準溶液中精確移取 1、2、3、4、5、7 mL 溶液至 10 mL 容量瓶中，甲醇定容，紫外分光光度計于328 nm處測定其吸光度[6]。以綠原酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，建立回歸方程。

2.1.2 水提法正交試驗

以水提法作為杜仲葉中綠原酸的提取方法。在單因素實驗的基礎上，選取料液比、提取時間、提取溫度為考察因素進行正交實驗，正交因素設計見表1。

準確稱取陰干粉碎后的杜仲葉2 g，以水為溶劑，按正交水平表的工藝條件提取2次。提取液過濾并減壓蒸干，用甲醇溶解，過濾除去不溶物。將濾液轉移至50 mL容量瓶中，甲醇定容。再從上述容量瓶中精確移取1 mL溶液到100 mL容量瓶中，定容，利用紫外可見光分光光度計測其吸光度，由標準曲線得出綠原酸含量并計算得率。

表1 正交因素表Table 1 Factors of orthogonal experiments

2.1.3 實驗結果

依據實驗數據，繪制標準曲線見圖1，建立回歸方程。

圖1 綠原酸標準曲線Fig.1 Standard curve of chlorogenic acid

由標準曲線可知，綠原酸在5mg/L～35mg/L濃度范圍內線性關系良好，回歸方程為：y=0.061 4x－0.056 39，r=0.999 79，SD=0.015 26。水提法提取綠原酸正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Result of orthogonal experiments

極差分析表明，各因素對綠原酸得率的影響程度為：C＞A＞B，即提取溫度對綠原酸得率影響最大，其次是料液比，影響最小的因素是提取時間。比較A、B、C等因素的K1、K2和K3數據，3個因素的最優組合是A2B1C2，即綠原酸水提法的最佳工藝條件是：料液比為1∶8，提取時間 70 min，提取溫度 80℃，以熱水作為溶劑提取杜仲葉2次，測得此條件下的綠原酸得率為1.78%。

2.2 綠原酸的純化工藝研究

2.2.1 綠原酸的純化

將杜仲葉陰干并粉碎，按2.1.3確定的最佳工藝進行提取。將提取物減壓濃縮得到粗提物。向粗提物中添加等量的工業酒精，經過多次的攪拌、沉淀，乙醇部分合并，減壓濃縮至無乙醇蒸出。通過此操作除去浸膏中大量的多糖、淀粉、蛋白質等得粗浸膏。利用D－101大孔吸附樹脂純化所得粗浸膏，水－乙醇進行梯度洗脫，收集水相部分，減壓濃縮得到浸膏。利用硅膠柱層析進一步對浸膏進行純化。以乙酸乙酯－甲醇進行梯度洗脫（乙酸乙酯－甲醇體積比分別為 1∶0，20∶1，10∶1，5∶1，10∶3，5∶2，2∶1，5∶3，10∶7，1∶1，0∶1），利用薄層層析，結合標準品對化合物進行比較。經薄層層析后發現5∶2梯度洗脫液含有與綠原酸標準品相同Rf值的斑點。經多次硅膠柱層析后，再以甲醇為洗脫劑，利用Sephadex LH－20凝膠柱層析進行純化。收集、合并與標準品具有相同Rf值斑點的洗脫液，揮干洗脫劑后得到白色固體。

2.2.2 化合物純度檢測與結構鑒定

以不同極性的展開劑將上述白色固體進行薄層層析，顯色后在紫外燈下進行觀察，看是否呈現單一斑點，若始終呈現單一的特征斑點；或利用熔點儀測定熔點，若熔程較短且與文獻值相符，可確定為純品化合物。

同時，利用1H－NMR、13C－NMR等波譜技術進行分析測定，確定化合物的結構。

2.2.3 結果

2.2.3.1 純度的檢測

分離得到的白色固體，易溶于乙醇、丙酮等極性溶劑，難溶于氯仿等低極性溶劑。經檢測其熔點為207℃～208℃，與綠原酸的熔點相同，向白色固體中加入少量綠原酸標準品，其熔點不發生變化。同時薄層色譜呈現出單一斑點，且與標準品有相同的Rf值，由此可初步確定白色固體為綠原酸。

2.2.3.2 結構鑒定

1H－NMR（400 Hz，DMSO－d6）δ：12.45（1H，s，H－7′）為羧基氫的信號峰；9.63（1H，s，H－4），9.19（1H，s，H－3）為苯環上羥基氫的信號峰；7.04（1H，d，J=1.8，H－2），7.00 （1H，dd，J=1.8Hz，8.2Hz，H －5），6.78 （1H，d，J=8.1Hz，H－6）為苯環上未被取代的氫原子信號峰；7.44（1H，d，J=15.9 Hz，H－7），6.17（1H，d，J=15.9 Hz，H－8）為烯基氫的信號峰；5.57，4.98，4.81為與六元環直接相連的羥基氫信號峰；5.08（1H，m，H－3′），3.57（1H，s，H－4′），3.92 （1H，s，H－5′），2.05 （2H，m，H－6′），1.95（2H，m，H－2′）為六元環上的氫原子信號峰。

13C－NMR （100 Hz，DMSO－ d6）δ：126.02 （C－1），116.17（C－2），148.79（C－3），145.43（C－4），115.20（C－5），121.84（C－6）為苯環上的六個碳原子的信號峰；146.00（C－7），114.69（C－8）為烯基碳的信號峰；166.17（C－9）為酯基碳的信號峰；73.84（C－1′），37.63（C－2′），68.42（C－3′），71.34（C－4′），70.68（C－5′），36.54（C－6′）為六元環上的碳原子信號峰；175.41（C－7′）為羧基碳的信號峰。

以上核磁數據與文獻[7]中綠原酸的數據基本一致，故鑒定該白色固體為綠原酸。

3 結論

研究表明杜仲葉中綠原酸的含量遠大于其皮中的含量。本文探討了杜仲葉中綠原酸的提取工藝，為開發利用該資源提供了有益的參考。杜仲葉中綠原酸的最佳水提工藝條件為：料液比1∶8，提取時間70 min，提取溫度80℃，以水作為溶劑提取杜仲葉2次，測得此條件下的綠原酸得率為1.78%。粗提物經醇沉工藝除雜后，依次利用D－101大孔吸附樹脂、硅膠柱層析、Sephadex LH－20凝膠柱層析對所得浸膏進行純化，分離得到的化合物經1H－NMR、13C－NMR波譜鑒定和文獻對比為綠原酸。

[1] 艾倫強,李婷婷,何銀生,等.杜仲的應用研究進展[J].亞太傳統醫藥,2010,6(10):163－165

[2] 蘭小艷,張學俊,龔桂珍.杜仲葉中綠原酸的研究進展[J].中國農學通報,2009,25(21):86－89

[3] 盧琪,段家彩,高麗,等.杜仲綠原酸的提取純化及結構鑒定[J].食品科學,2010,31(14):275－279

[4] 張軍民,高振川,張琪,等.杜仲葉及提取物營養價值和藥用成分研究[J].氨基酸和生物資源,2002,24(1):1－2

[5] 張英鋒,張立艷,馬子川,等.植物綠原酸的研究進展[J].中國教育,2011(4):1－2

[6] 向昌國,李文芳,聶琴,等.甘薯莖葉中綠原酸提取方法的研究及含量測定[J].食品科學,2007,28:126－130

[7] 陳立娜,李萍.牽牛子化學成分研究[J].林產化學與工業,2007,27(6):105－108