大豆提取液中大豆黃素的紫外分光光度測定法

蔣盼，顧建明

（上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200444）

異黃酮（isoflavone）在自然界中的分布只局限于豆科的蝶形花亞科等少數(shù)植物中，其中含量較高的有苜蓿、紅三葉草和大豆（Giycine max（L）Merrill）。大豆異黃酮主要分布于大豆種子的子葉和胚軸中，種皮中含量極少，是大豆生長過程中形成的次級代謝產(chǎn)物，屬黃酮類中的異黃酮多酚化合物，是大豆中主要的生理活性物質(zhì)。在大豆中存在十二種異黃酮，按照結(jié)構(gòu)可以分為四類：游離型異黃酮苷元（aglucone）、葡萄糖苷（glucoside）、乙酰基葡萄糖苷（acetylglucoside）和丙二酰基葡萄糖苷（malonylucoside）。其中對人體的起主要生理作用的是游離型異黃酮苷元[1-5]：染料木素（genistein），大豆黃素（daidzein），黃豆黃素（glycitein）。

近年來，動物實驗、體外實驗以及臨床實驗的研究表明，大豆異黃酮對人體具有保健功能，主要有：（1）雌激素樣作用，由于其結(jié)構(gòu)與女性雌激素內(nèi)源雌二醇相似，能維持女性雌激素水平的平衡，緩解婦女更年期綜合癥[6-7]；（2）預(yù)防骨質(zhì)酥松癥[8-9]；（3）調(diào)節(jié)血脂以及抗動脈粥樣硬化[10-11]；（4）抗氧化活性[12-13]；（5）緩解心血管疾病[14]；（6）抗癌作用[15-16]等。

在日常生活中，大豆制品是人們攝取大豆異黃酮的主要膳食來源，研究表明，加工過程會造成大豆異黃酮的顯著損失，其中，浸泡使12%的大豆異黃酮流失于浸泡水中；凝固使44%大豆異黃酮丟失于乳清溶液中[17-18]，這些含保健功能物質(zhì)的廢棄排放物也污染了環(huán)境，因此，豆制品加工過程中大豆異黃酮的回收利用具有研究價值。

目前檢測大豆異黃酮常用的方法[19]有紫外分光光度法和高效液相色譜法。高效液相色譜法靈敏、重現(xiàn)性好，但需要專門的人員操作維護(hù)，成本高。紫外分光光度法簡單、方便、快速但精密度低。本實驗旨在通過研究大豆提取液中大豆黃素的紫外分光光度和HPLC測定結(jié)果間的差異，建立一新的準(zhǔn)確的大豆黃素的紫外分光光度測定法。這對工業(yè)化豆制品加工生產(chǎn)中準(zhǔn)確、方便、快速檢測、回收和利用大豆異黃酮資源都具有十分重要的意義。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和儀器

黃豆（當(dāng)?shù)爻匈徺I）；甲醇（色譜純），乙腈（色譜純），濃磷酸（分析純，≥85%），BHT（色譜純，purity≥99%）；大豆黃素（daidzein，purity≥99%）購自田同生化技術(shù)有限公司。

UV-754紫外可見分光光度計，恒溫干燥箱，水浴鍋，YXJ-1 型低速離心機，AB104（METTL ER-TOLEDO Group，Max101g，d=0.1mg） 電子分析天平，LC-20A（SPD-20A紫外檢測器、CTO-10AS柱溫箱、LC-20AT泵）高效液相色譜儀：日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆黃素紫外吸收波長的測定

準(zhǔn)確稱取大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)樣品大豆黃素5 mg，甲醇溶解后，定容于50 mL容量瓶中，配置成0.1 mg/mL的母液。在199 nm～400 nm紫外區(qū)掃描。4℃下保存[20]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.2.1 高效液相色譜法

準(zhǔn)確吸取 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 1.2.1 中配置的母液于10 mL容量瓶中，甲醇定容，配置成1、2、4、6、8、10 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用 Ф13 mm，孔徑為0.45μm的有機針孔過濾器過濾于進(jìn)樣瓶中，在色譜柱CLC-NH2（Ф6 mm×150 mm），流動相：V乙腈∶V0.001%磷酸=28∶72，流速 0.7 mL/min，柱溫 40 ℃，檢測波長 230 nm條件下，進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測定，繪制濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 紫外分光光度法

將1.2.2.1中的大豆黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液用UV-754紫外可見分光光度計在特定波長下測定吸光度值A(chǔ)，其中波長為1.2.1掃描圖中讀出的最大吸收波長，繪制濃度與吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 樣品的制備和測定

壓制黃豆至厚度為0.35 cm，稱取50 g于燒杯中。往燒杯中添加水（第一次加120 mL，以后每次加100 mL），置50℃水浴中，每隔20 min收集一次浸泡液，重復(fù)10次。收集浸提液后，4℃下保存。

取20 mL浸提液，加入25 mL甲醇溶液，50 mL，4 mol/L鹽酸溶液，0.75 g BHT。44.6℃下水浴回流3 h，過濾，收集上清液，用甲醇定容至100 mL[21]。4℃下保存。取處理好的黃豆浸提液，在相同色譜條件下測定其大豆黃素的峰面積；在相同紫外波長條件下測定吸光度值。

1.2.4 紫外和HPLC測定方法的比較

將黃豆浸提液按表1準(zhǔn)確稀釋成6種不同濃度樣品，該系列濃度涵蓋UV和HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線的有效范圍。在最大吸收波長下用紫外法測量它們的吸光度值A(chǔ)，根據(jù)1.2.2.2繪制的紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各稀釋樣品的濃度值，每種稀釋樣品重復(fù)測定5次。同樣也用HPLC法測得各稀釋樣品的濃度值，每種稀釋樣品重復(fù)測定5次。對每種稀釋樣品的紫外和HPLC測定值間進(jìn)行差異性檢驗（t檢驗法）。

表1 黃豆浸提液樣品的制備Table 1 Dilution factor of soy extraction sample

1.2.5 紫外法標(biāo)準(zhǔn)曲線的矯正方法

設(shè)HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為YHPLC=k1XHPLC+b1，紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y紫外=k2X紫外+b2，矯正后的的紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=kX+b，用表1中樣品1和樣品5紫外和HPLC測得的值代入矯正后的方程得下列二元一次方程組：

解此方程組，得k和b值，即可求得矯正后的紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=kX+b，再按1.2.4的測定程序，檢測矯正后的紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線測得值與HPLC測得值間是否存在差異。

1.2.6 精密度和準(zhǔn)確度測定

準(zhǔn)確吸取黃豆浸提液樣品1 mL于甲醇定容至10 mL，在最大吸收波長下測定其吸光度值A(chǔ)，并根據(jù)1.2.5繪制的曲線計算其濃度，重復(fù)5次，計算RSD值。

取黃豆浸提泡液1 mL 6份于10 mL具塞試管中，再分別準(zhǔn)確加入 1.2.2.1 中標(biāo)準(zhǔn)品溶液 1、1、1、2、2、2 mL，用甲醇定容至10 mL，混勻后在最大吸收波長下測定吸光度值A(chǔ)。根據(jù)1.2.5繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算大豆黃素的濃度值，按（測得大豆黃素量-原樣品量）/加樣量×100%計算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆黃素的紫外吸收波長

大豆黃素在248 nm處有最大吸收值，如圖1。

2.2 兩種測定方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法測定結(jié)果見圖2、圖3、圖4。

HPLC法測得的大豆黃素濃度與峰面積方程為y=104 835x+4 119.7，R2=0.990 9，濃度與峰面積呈較好的線性關(guān)系，大豆黃素的高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

2.2.2 紫外分光光度法

紫外分光光度法法測得的大豆黃素濃度與吸光度分別為y=6.959x-0.002 7，R2=0.997 7，濃度與吸光度呈較好的線性關(guān)系，如圖5。

圖5 大豆黃素UV標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Daidzein standard curve between concentration and absorbency

2.3 兩種方法測定樣品濃度值的差異性及其矯正

表2選取列出了大豆浸提液稀釋液樣品2、4、6紫外法和HPLC法測得的濃度值和差異性，查表得t0.01，5=4.032 1，計算得出的 t均大于 t0.01，5，即用 2.2.2中的 UV和HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線方程測得的濃度值間存在極顯著性差異，因此，需要對原紫外吸光度與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行矯正。

表2 第2、4、6號樣品紫外和HPLC測定值間的比較Table 2 The daidzein content difference by UV and HPLC（sample 2，4，6）

按照1.2.5中方法對原紫外法曲線進(jìn)行矯正，得到新的紫外法標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.706 1x+0.012 5（見圖6）。采用此方程測得的大豆浸提液稀釋樣品濃度值與HPLC測得的值差異性分析見表3（表中僅列出稀釋樣品 1，3，5），t均小于 t0.01，5，UV 法與 HPLC 法測定值間已無顯著性差異。

2.4 精密度和準(zhǔn)確度

矯正后紫外法測定大豆黃素的精密度和準(zhǔn)確度測定結(jié)果分別見表4和表5，平均回收率為99.128%。

表3 第1、3、5號樣品紫外（矯正后）和HPLC測定值間的比較Table 2 The daidzein content difference by UV（corrected）and HPLC（sample 1，3，5）

表4 大豆黃素的精密度Table 4 Precision of daidzein detection

表5 大豆黃素曲線的準(zhǔn)確度（×10-3mg）Table 5 Accuracy of daidzein detection（×10-3mg）

大豆浸提液中不僅含有大豆黃素，還含有黃豆黃素、染料木素等大豆異黃酮，這些黃酮類物質(zhì)由于含有苯環(huán)，在248 nm處都有弱紫外吸收，這就構(gòu)成了對用紫外法測定大豆黃素的含量的干擾。故需要對吸光度與濃度的曲線進(jìn)行矯正，矯正所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度和精密度均較好。

3 結(jié)論

由于大豆提取液中存在許多影響大豆黃素的測定結(jié)果物質(zhì)，如黃豆黃素、染料木素及其它在248nm有吸收的化學(xué)成分，從液相色譜法和紫外法測定的結(jié)果即可以看出。以液相色譜法測定的大豆黃素濃度值作為可信值，對紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行矯正，得到新的紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.706 1x+0.012 5，該方程可準(zhǔn)確、快速、方便地運用于大豆提取液中大豆黃素的測定，該研究方法也可為其它大豆異黃酮的紫外測定所借鑒。

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