毛細管電泳法對乳及乳制品中乳源蛋白的測定

田蘭，陳春麗，馬曉麗，孟磊，熱娜·卡斯木

（新疆醫科大學藥學院，新疆烏魯木齊830011）

乳及乳制品具有較高的營養價值，是人體獲取蛋白質的重要途徑。近年來，國內乳制品摻假現象嚴重，如三聚氰胺、皮革水解蛋白等非法物質的添加，嚴重損害消費者的利益和健康。國家制定的常規檢驗方法，不能將乳品中摻入的非乳蛋白區別檢測。因此，從乳制品的特征性成分——乳源蛋白出發，對其進行定性定量表征，并由此對乳及乳制品在生產、流通、儲存各個環節的質量品質進行分析、評價，控制，對于乳品行業的良性發展具有重要的意義[1]。

鮮牛乳含有3.0%～3.5%蛋白質，其中80%的為酪蛋白（CN），15%為乳清蛋白。酪蛋白分別為：α－酪蛋白（α－CN），β－酪蛋白（β－CN），k－酪蛋白（k－CN），乳清蛋白是在牛乳清液中，此類蛋白質主要是α－乳白蛋白（α－La）和 β－乳球蛋白（β－Lg）。乳蛋白由于遺傳和非遺傳的多態性以及應用的加工處理方法，使它們的定量測定變得十分復雜。毛細管電泳使分析化學得以從微升水平進入納升水平，并使單細胞分析，乃至單分子分析成為可能。長期困擾我們的生物大分子如蛋白質的分離分析也因此有了新的轉機。高效毛細管電泳技術因其高效、快速、微量、經濟、自動化等優點被廣泛應用于蛋白的分析[2－5]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

P/ACE MDQ毛細管電泳儀：Beckman公司（配有紫外檢測器）；聚乙烯醇涂層毛細管柱：Beckman公司（65 cm×50 μm I.D.，有效長度 47 cm）；PB－ Satorius普及型10pH計：賽托利斯科學儀器（北京）有限公司；MS3 basic渦旋振蕩器：德國IKA；Milli－Q Advantage A10超純水儀：美國密理博；TGL－16G離心機：上海菲恰爾分析儀器有限公司；KQ－3200DV型數控超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

α－乳白蛋白（α－La），β－乳球蛋白（β－Lg），α－酪蛋白（α－CN），β－酪蛋白（β－CN），k－酪蛋白（k－CN）標準品：Sigma公司；羥丙基甲基纖維素（HPMC）：進口分裝；DL－二硫蘇糖醇（DTT）生物試劑：Merk；三羥甲基胺基甲烷（Tris）：上海藍季科技發展有限公司，檸檬酸，檸檬酸鈉，尿素，磷酸、氫氧化鈉均為分析純；

原料乳取自本地某乳品生產廠家，市售鮮奶購自本地集市，其它樣品均購自本地超市。

1.2 方法

1.2.1 實驗條件

1.2.1.1 運行緩沖液制備

準確稱取0.295 4 g檸檬酸鈉，0.156 g二硫代蘇糖醇（DTT），2.0111g三羥甲基胺基甲烷（Tris），置于100mL容量瓶中，加入6 mol/L尿素溶液75 mL，用H3PO4調節pH至8.0，置于冰箱中備用。

1.2.1.2 樣品緩沖液制備

準確稱取4.208 3 g檸檬酸，0.582 8，g檸檬酸鈉，0.05%羥丙基甲基纖維素，置于100 mL容量瓶中，加入6 mol/L尿素溶液75 mL，用1 mol/L NaOH調節pH至3.0，備用。

1.2.1.3 操作條件

分離電壓20 kV；壓力進樣0.5 psi，時間5 s；柱溫：40℃；紫外檢測波長：214 nm；毛細管兩次進樣之間用水沖洗5 min，檸檬酸緩沖液沖洗5 min，在1 min時自動調零。

1.2.2 樣品處理

1.2.2.1 原料乳、液態奶樣品的配制

將樣品與樣品緩沖溶液按1∶4（體積比）的比例混合，室溫下放置1 h，10 000 r/min離心，取清液，用0.45 μm的濾膜過濾后直接進樣。

1.2.2.2 酸奶樣品

稱取0.4 g酸奶，，加樣品緩沖溶液約1.6 mL，至離心管2 mL處，混合，室溫下放置1 h，10 000 r/min離心，取清液，用0.45 μm的濾膜過濾后直接進樣。

1.2.2.3 奶粉樣品的準備

稱取1 g奶粉，溶于10 mL水中，超聲振蕩使其充分溶解平衡。將樣品溶液與樣品緩沖溶液按1∶4（體積比）的比例混合，室溫下放置1 h，10 000 r/min離心，取清夜，用0.45 μm的濾膜過濾后直接進樣。

1.2.3 標準溶液的配制

分別配制 α－La 、β－Lg、α－CN、β－CN、k－CN 的標準儲備液：15、20、30、40、20 mg/mL，并置于冰箱中保存。上述標準溶液均同樣經樣品緩沖液處理后進樣。

2 結果與討論

2.1 方法學考察

2.1.1 線性范圍

在1.2.1.3操作條件下，五種蛋白標準品高效毛細管電泳圖譜如圖1所示。

以5種標準蛋白的峰面積的峰面積為縱坐標，以標樣的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，并利用最小二階乘法進行線性回歸，得到各蛋白的線性范圍、回歸方程及相關系數，結果如表1所示。

2.1.2 精密度

表1 方法的分析特征Table 1 Analytical characteristics of the method

取同一樣品溶液，在1.2.1.3操作條件下，連續進樣6次，測定進樣精密度；取不同濃度的三份樣品（三種濃度樣品中5種蛋白總含量分別為31.41 mg/mL，21.96 mg/mL和328.54 mg/g進行測定，記錄色譜峰面積，計算進樣峰面積，得RSD結果如表2所示。

表2 乳蛋白的精密度Table 2 Precision of milk proteins

2.1.3 回收率

精密量取適量液態奶樣品，平行取12份，3份空白，其余9分別加入低中高3種濃度的標準品溶液，按1.2.2.1方法處理，在1.2.1.3操作條件下測定，加標回收率測定結果如表3所示。

2.1.4 穩定性

2.1.4.1 測試穩定性

將樣品按1.2.2.1項下方法處理之后，在0、12、24、36、40、48、60、64、68、72 h 按 1.2.1.3 操作條件測定測定，結果如表4所示。

結果顯示，樣品處理完之后需在64h內完成測定。

2.1.4.2 儲存穩定性

將樣品置于4℃冰箱保存，分別于24、36、48、72 h按項下進行樣品處理，測定，并考察于－18℃保存24 h情況，結果如表5所示。

表3 乳蛋白的加標回收率（n=3）Table 3 Recoveries of the method

表4 乳蛋白測試穩定性Table 4 Stability of milk protein during testing

結果顯示，樣品可在4℃冰箱中保存72 h測定，不適合在－18℃冰箱中存儲。

2.2 樣品測定

分別取液態奶、酸奶和奶粉樣品，按1.2.2.1項下方法處理之后，在1.2.1.3操作條件下測定，液態奶樣品、酸奶樣品及奶粉樣品測定所得圖譜如圖2、圖3、圖4所示，結果如表6所示。

從表6的結果可以看出，本高效毛細管電泳測定方法測得5種蛋白總量的結果與樣品包裝標示量結果相符。

3 結論

1）本方法適用于液態奶、液態乳制品、酸奶及奶粉中乳蛋白的分析研究。

2）在對各種樣品的測定中發現，各樣品除了蛋白含量不同，圖譜也有差異，可以結合乳制品形態、奶源、乳牛喂養、產地、加工工藝等各方面對原料乳及乳制品的進行品質控制。也可以借鑒中藥指紋圖譜的分析方法，為原料乳及乳制品建立相應的乳蛋白圖譜，并進行更為深入透徹的解析。

表5 乳蛋白儲存穩定性Table 5 Storing stability of milk protein

表6 乳及乳制品中乳蛋白含量測定Table 6 Samples determination of milk and milk products

3）本高效毛細管電泳方法與較為常用的分析手段高效液相（HPLC）法相比，HPLC法主要測定乳品中氨基酸的含量，該方法前處理方法簡單（不需要衍生），溶劑消耗低，簡單易行。但高效毛細管電泳測定乳蛋白需要使用涂層毛細管柱，價格較高，使用壽命有限（約200份樣品，bekman工程師提供信息），5種乳蛋白的價格也較高。從方法學數據可以看出，高效毛細管電泳測定蛋白質含量的精密度、重現性、準確度與高效液相色譜的常規測試中RSD＜2%相比，有一定差距，毛細管電泳技術的局限及蛋白質的特性限制了高效毛細管電泳在蛋白測定中的應用。

[1] 宋宏新,柏紅梅,薛海燕,等.基于乳源蛋白質分析的乳品質量檢測技術探討[J].食品工業科技,2008,29(9):298－301

[2] 李春,劉麗波,劉寧.毛細管電泳技術評價乳制品質量的研究[J].食品工業科技,2008,29(5):288－290

[3] Patrick Clement,Samson O Agboolab,Roberta Bencini.A study of polymorphism in milk proteins from local and imported dairy sheep in Australia by capillary electrophoresis[J].LWT,2006,39(1):63－69

[4] J M L Heck,C Oliemanb,A Schenninkc,et al.Estimation of variation in concentration,hosphorylation and geneticpolymorphism of milk proteins using capillary zone electrophoresis[J].International Dairy Journal,2008,18(5):548－555

[5] 劉婷,姜金斗,劉寧.毛細管電泳檢測奶粉中添加的大豆分離蛋白[J].分析科學學報,2008,24(1):37－41