脂肪干細(xì)胞復(fù)合載杜仲醇提取物支架材料修復(fù)兔下頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

房殿吉　郭延偉　李松等

[摘要] 目的 探討杜仲醇提取物對脂肪干細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用及脂肪干細(xì)胞復(fù)合載杜仲醇提取物支架材料應(yīng)用于頜骨缺損修復(fù)的可行性。方法 將48只新西蘭大白兔隨機(jī)分為4組，并制備雙側(cè)下頜骨缺損模型。A組植入脂肪干細(xì)胞復(fù)合載杜仲醇提取物支架材料；B組植入脂肪干細(xì)胞復(fù)合羥磷灰石材料；C組單植入羥磷灰石材料；D組為空白組。分別于術(shù)后2、4、8、12周處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制備組織標(biāo)本，行大體觀察、影像學(xué)分析、蘇木精-伊紅（HE）染色、掃描電鏡（SEM）檢測，并對影像學(xué)分析值及成骨情況進(jìn)行評價(jià)，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果 影像學(xué)檢查及組織學(xué)染色顯示A組骨缺損處愈合程度、成骨速度及其質(zhì)量明顯優(yōu)于其他3組。SEM觀察可見，A組復(fù)合材料與組織相容性好，無炎癥刺激反應(yīng)。統(tǒng)計(jì)牙CT分析數(shù)據(jù)及新生骨面積，A組的成骨情況優(yōu)于其他3組（P<0.05）。結(jié)論 杜仲醇提取物有促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，脂肪干細(xì)胞復(fù)合載杜仲醇提取物支架材料也具有明顯骨誘導(dǎo)作用，是一種新型復(fù)合材料，可望成為臨床應(yīng)用中修復(fù)下頜骨缺損的新型材料。

[關(guān)鍵詞] 骨； 下頜骨缺損； 杜仲醇提取物； 脂肪干細(xì)胞； 羥磷灰石

[中圖分類號(hào)] Q 254 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.017 近年來隨著組織工程學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，利用種子細(xì)胞復(fù)合支架材料修復(fù)骨缺損成為新的研究方向，以往骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞一直是研究的熱點(diǎn)[1-2]，但由于人體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓單核細(xì)胞中所占比例較少，且隨著年齡的增大比例逐年下降，尤其老年人獲取數(shù)量更少，從而限制了其在臨床的應(yīng)用。脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）作為新的種子細(xì)胞，由于其有來源豐富、取材方便、對機(jī)體組織損傷小、增殖快、能多向分化、獲取數(shù)量大等眾多優(yōu)點(diǎn)迅速成為新的研

究熱點(diǎn)[3-4]。大量研究發(fā)現(xiàn)中藥杜仲能刺激骨髓干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化[5-7]，因?yàn)锳DSCs與骨髓干細(xì)胞

有相同的表面黏附因子和受體分子，所以有同樣的多向分化潛能。本研究將探討杜仲醇提取物對ADSCs的成骨分化促進(jìn)作用和以ADSCs為種子細(xì)胞復(fù)合載杜仲醇提取物支架材料修復(fù)頜骨缺損中的作用，為臨床治療下頜骨缺損提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的健康新西蘭大白兔48只為研究對象，體重2.0～3.0 kg，6月齡，雌雄不限。

1.2 材料

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶（Gibco公司，美國），胰島素、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉（Sigma公司，美國），醫(yī)用納米級羥磷灰石（上海源葉生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 杜仲醇提取物的制備 2 g鹽杜仲（山東省濟(jì)南市漱玉大藥房，1包1 g，生產(chǎn)批號(hào)：110316）加入甲醇至15 mL，室溫振蕩1 h，靜置過夜，15 000 r·min-1離心10 min，棄沉淀。甲醇浸上清經(jīng)真空濃縮，再加水15 mL溶解后得醇提取物。醇提取物均經(jīng)0.22 Em膜過濾，-20 ℃保存。

1.3.2 兔ADSCs的分離和培養(yǎng) 麻醉下取兔兩側(cè)腹股溝脂肪組織，置于培養(yǎng)皿中，無菌條件下清除小血管、外包膜和軟組織，PBS緩沖液沖洗3次，眼科剪剪碎，用1 g·L-1Ⅰ型膠原酶37 ℃水浴下消化1.5 h至糊狀，2 600 r·min-1離心10 min，除去上清和上層懸浮油性脂肪組織，D-HANK S液洗滌沉淀2次。用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基稀釋，過濾，離心，將細(xì)胞收集到培養(yǎng)瓶中。于37 ℃飽和濕度，體積分?jǐn)?shù)5%CO2中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞融合80%～90%時(shí)，用含0.25%胰酶消化，傳代培養(yǎng)后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，茜素紅染色進(jìn)行成骨鑒定。

1.3.3 復(fù)合材料的制備 將培養(yǎng)第6代的ADSCs經(jīng)胰蛋白酶消化和離心后與杜仲醇提取物15 mL復(fù)合，細(xì)胞計(jì)數(shù)，制成的細(xì)胞懸液濃度為每毫升2×107個(gè)。而后將羥磷灰石置于培養(yǎng)皿中，細(xì)胞懸液反復(fù)滴加到支架材料上，保證支架材料完全浸潤。同時(shí)在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，使ADSCs更好地進(jìn)入支架材料的孔隙中。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)分組 將制備成下頜骨缺損模型的48只新西蘭大白兔分為4組。A組植入ADSCs復(fù)合載杜仲醇提取物支架材料；B組植入ADSCs復(fù)合羥磷灰石材料；C組單植入羥磷灰石復(fù)合材料；D組為空白組，不植入任何材料。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱重后，20%烏拉坦（5 mL·kg-1）耳緣靜脈注射麻醉。常規(guī)備皮消毒鋪巾，沿下頜骨下緣做平行切口，長度3～4 cm，分層切開皮膚皮下組織，暴露下頜骨下緣及頰面，用裂鉆在下頜骨體頰側(cè)中下處制備直徑為1 cm的全層骨缺損，深度為0.5～0.6 cm，注意術(shù)中生理鹽水降溫，不損傷對側(cè)骨膜層結(jié)構(gòu)。手術(shù)中，A、B、C組按分組植入相應(yīng)材料，D組制備缺損后直接縫合。充填完畢后，分層嚴(yán)密縫合切口，分籠飼養(yǎng)。術(shù)后肌注慶大霉素預(yù)防感染，劑量為每次2萬單位，1 d2次，持續(xù)5 d。分別于術(shù)后2、4、8、12周靜脈栓塞法處死動(dòng)物，獲取兔雙側(cè)完整下頜骨標(biāo)本。

1.3.5 觀察指標(biāo) 觀察指標(biāo)具體如下。1）大體觀察：觀察骨缺損區(qū)表面情況及新骨形成和材料吸收情況，探針檢測缺損表面骨形成硬度。2）影像學(xué)分析：X線片觀察骨缺損區(qū)外形及材料的改變情況，材料與周圍組織接觸情況。牙CT掃描骨缺損區(qū)內(nèi)8個(gè)不同位點(diǎn)，并記錄CT值，取均值。3）組織學(xué)觀察：于骨缺損區(qū)周圍0.5 mm處取材，4%多聚甲醛固定24 h后常規(guī)脫鈣處理，而后將標(biāo)本浸蠟、包埋、切片、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光鏡下進(jìn)行觀察。4）掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察：將組織塊置于4%戊二醛固定液24 h取出，PBS液沖洗3次，梯度乙醇脫水，醋酸異鎢酯中置換15 min，SEM檢測材料與周圍組織密合情況及生物相容性。5）計(jì)算機(jī)圖像分析：術(shù)后4個(gè)時(shí)間段所有組織連續(xù)切片后系統(tǒng)選片，每塊組織選5張，光鏡（100倍）下每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野，在圖像分析儀下進(jìn)行組織學(xué)形態(tài)分析，測定術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上新生骨小梁面積所占修復(fù)區(qū)面積的比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對CT值及新骨形成面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，組間和組內(nèi)CT值及新骨形成面積差異的比較采用t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs的培養(yǎng)及成骨鑒定結(jié)果

倒置顯微鏡下可見原代細(xì)胞4～6 h后開始沉降；24 h后基本貼壁；2～4 d后呈梭形或小多角形，突起相互連接；7 d后大量增殖，呈束狀或漩渦狀排列。傳代后呈梭形，形態(tài)大小較一致，各代細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，呈成纖維細(xì)胞樣生長。14 d后茜素紅礦化

結(jié)節(jié)染色說明分化形成的細(xì)胞為成骨細(xì)胞（圖1、2）。

2.2 大體觀察結(jié)果

術(shù)后2周，A組骨缺損區(qū)材料與周邊組織固位良好，界清，材料有小部分吸收；B組和C組缺損區(qū)有包膜包裹，有炎性滲出，材料完整；D組見少量纖維形成，炎性增生。術(shù)后4周，A組缺損區(qū)大量紅色纖維組織，有骨痂形成，硬度增加，材料部分溶解吸收；B組缺損區(qū)材料與周圍骨質(zhì)界限明顯，材料留存明顯，骨痂較少；C組材料界清，材料未被吸收；D組見大量纖維組織生成。術(shù)后8、12周，A組骨缺損區(qū)材料基本吸收，缺損區(qū)被骨組織取代；B組與C組見缺損區(qū)有新骨形成，但硬度不高，仍見少量材料殘留；D組見大量纖維組織，未見成骨形成。

2.3 X線片檢查結(jié)果

術(shù)后2周，3組缺損區(qū)清晰可見，差別不明顯。術(shù)后4周時(shí)，A組缺損區(qū)有少量骨痂形成，材料與周邊組織接觸緊密，邊界模糊，密度低于正常骨；B組缺損邊界仍清晰，材料無明顯變化；C組缺損區(qū)材料阻射影清楚，低密度影多；D組邊界清晰，低密度影明顯。術(shù)后8周，A組缺損區(qū)材料吸收，邊界模糊，高密度區(qū)面積增多，邊界尚清；B組缺損區(qū)可見絮狀高密度影，骨密度較低，與周圍界限尚清；C組低密度影明顯與周圍界清；D組界清，大片低密度影，缺損區(qū)內(nèi)密度值明顯低于正常。術(shù)后12周，A組缺損區(qū)材料基本吸收，邊界模糊不清，材料與骨有骨性連接，其與組缺損區(qū)邊界不清但仍可見，邊緣與骨質(zhì)有帶狀低密度影；B組優(yōu)于C組；D組缺損區(qū)邊界尚清，未見高密度影形成（圖3）。

2.4 組織學(xué)觀察結(jié)果

術(shù)后2、4周時(shí)，A組可見大量纖維骨痂，成骨細(xì)胞形成，材料略有減少；其余3組可見多生肉芽組織，材料與骨質(zhì)仍界清。術(shù)后8周時(shí)，A組材料吸收明顯，有新生骨長入，大量成骨細(xì)胞，材料內(nèi)有纖維組織生成，骨小梁排列不規(guī)則；B組見骨痂形成明顯，材料有少量吸收；C組殘存材料明顯；D組見大量成纖維組織和炎性肉芽組織，未見成骨。12周時(shí)，A組材料基本吸收，大量纖維骨痂組織生成骨組織，骨小梁排列緊密規(guī)則，密度增大；B組成骨小于A組，骨小梁較少，材料仍有部分殘留，骨小梁排列不規(guī)則，可見新的纖維骨痂生成；C組成骨不如B組；D組纖維增生明顯（圖4）。

2.5 SEM觀察結(jié)果

2周時(shí)，4組缺損區(qū)材料均與周圍骨界限有裂隙。術(shù)后4周時(shí)，A組材料與骨組織結(jié)合，二者之間結(jié)合緊密，有大量膠原纖維組織長入材料，骨痂生成明顯，其余3組材料與周圍骨質(zhì)界限清晰，結(jié)合仍有裂隙，有少量膠原纖維長入。術(shù)后8、12周，A組材料與骨質(zhì)界限不清，形成大量新生骨，材料基本吸收；B組纖維組織向材料中心長入，材料周圍有鈣化；C

組在缺損邊界鈣化；D組未見硬化組織，缺隙明顯（圖5）。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

通過對各時(shí)間段4組骨缺損區(qū)修復(fù)CT值測量結(jié)果比較分析可見：A組與其他3組兩兩比較，其CT值明顯高于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。通過對各時(shí)間段4組新生骨面積占骨缺損面積的百分比測量結(jié)果比較分析可見：A組與其他3組兩兩比較，其新生骨面積明顯高于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

3 討論

當(dāng)今社會(huì)中，由于炎癥腫瘤外傷等原因所致頜骨缺損患者的數(shù)量一直居高不下，而頜骨由于其解剖和功能上的特殊性，其缺損的修復(fù)一直是口腔頜面外科研究的熱點(diǎn)之一[8]。

骨缺損的修復(fù)方法有很多，隨著當(dāng)代骨組織工程和細(xì)胞分子生物工程的迅猛發(fā)展，種子細(xì)胞復(fù)合支架材料成為骨缺損修復(fù)研究進(jìn)程中的主要熱點(diǎn)之一[9-11]，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是早期研究的種子細(xì)胞之一[12-14]，其成骨作用明顯受到重視，但由于其來源匱

乏，制約了其在臨床上的應(yīng)用。近年來ADSCs作為新的種子細(xì)胞來源出現(xiàn)在人們面前[15-17]，其本身所具有的取材容易、安全性高、獲取率高、自我更新速

度快和多向分化等優(yōu)點(diǎn)成為新的研究熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過ADSCs的制備、分離培養(yǎng)及擴(kuò)增，并將其接種于載杜仲醇提取物的支架材料上，通過杜仲促進(jìn)ADSCs向成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化刺激成骨，具有良好的生物安全性和生物相容性。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的研究過程和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)A組成骨效果明顯優(yōu)于其他3組。影像學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：在8周時(shí)，A組材料的吸收比較明顯，成骨邊界模糊不清；B、C組只有一定降解；D組界清，大片低密度影。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：在12周時(shí)，A組材料基本降解，骨質(zhì)成熟，骨小梁排列整齊；B組成骨小于A組，骨小梁較少，排列不規(guī)則；C組成骨不及B組；D組纖維增生明顯。SEM觀察發(fā)現(xiàn)：在12周時(shí)，A組已有良好新骨生成，材料降解完成，并與骨組織結(jié)合緊密；B組只有少量骨痂形成；C組見大量纖維組織，邊緣鈣化嚴(yán)重；D組缺隙明顯，未見硬組織生成。最后經(jīng)過影像學(xué)數(shù)據(jù)及計(jì)算機(jī)圖像分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的分析得到各組新生骨及骨密度均有增加，但A組明顯優(yōu)于其他3組，A組材料具有較高成骨性能，具有加速成骨的作用。

目前大量的研究成果證明種子細(xì)胞在骨科領(lǐng)域有著巨大前景，其成骨分化潛能和多向分化能力使其與支架材料復(fù)合后成功應(yīng)用于動(dòng)物骨缺損修復(fù)過程中[18-20]。本實(shí)驗(yàn)以ADSCs為種子細(xì)胞復(fù)合載杜仲醇

提取物支架材料修復(fù)兔下頜骨缺損，研究證實(shí)了杜仲醇提取物對ADSCs成骨的誘導(dǎo)作用及其復(fù)合材料應(yīng)用于頜骨缺損中的良好生物相容性和修復(fù)可行性，但復(fù)合材料的最適宜比例和移植后相關(guān)影響因素尚不十分清楚，有待于進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 杜冰）