蟲害馬尾松揮發性化學物質變化規律及其誘導鄰近馬尾松抗性的初步研究

王麗霞，徐志宏*，陳為民，孫品雷，巫冬江，俞春來，包春泉

（1. 浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江 臨安 311300；2. 杭州市森林和野生動物保護管理總站，浙江 杭州 310009；3. 浙江省淳安縣森林病蟲害防治檢疫站，浙江 淳安 311700；4. 浙江省桐廬縣森林病蟲防治站，浙江 桐廬 311500）

蟲害馬尾松揮發性化學物質變化規律及其誘導鄰近馬尾松抗性的初步研究

王麗霞1，徐志宏1*，陳為民2，孫品雷2，巫冬江2，俞春來3，包春泉4

（1. 浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江 臨安 311300；2. 杭州市森林和野生動物保護管理總站，浙江 杭州 310009；3. 浙江省淳安縣森林病蟲害防治檢疫站，浙江 淳安 311700；4. 浙江省桐廬縣森林病蟲防治站，浙江 桐廬 311500）

采用HS/SPME-GC/MS分析了馬尾松蟲害植株與健康株主干樹皮揮發性物質的成分及其含量，對蟲害和健康馬尾松主干樹皮揮發性物質的變化規律進行對比研究。結果表明：蟲害馬尾松主干樹皮揮發物的主要成分是萜烯類化合物，分別是 α-蒎烯、β-蒎烯、α-水芹烯、β-月桂烯、D-檸檬烯、石竹烯等，其次是十一烷和十二烷；與對照相比，蟲害馬尾松植株主干樹皮揮發性物質的種類和含量明顯低于對照，證明馬尾松受到蟲害后，體內的防御系統被破壞，馬尾松樹體抗性明顯下降；同時蟲害附近的健康株主干樹皮揮發性物質的種類和含量明顯高于對照，證明馬尾松受到蟲害后，可以誘導鄰近馬尾松樹體啟動了體內的防御系統，從而使其產生抗性。

馬尾松；鄰近植株；揮發性化學物質；變化規律

植食性昆蟲誘導的植物揮發物可以抵御昆蟲侵害或者吸引它們的天敵，也可以誘導鄰近植物產生防御反應[1～2]，已有的研究表明：當豆科植物葉片受到螨蟲危害后，受傷害的葉片將釋放揮發性物質促成了植物間的相互感應，這種由植物向高層營養級所發出的介質信號被稱為“求救信號”[3]。David C Degenhardt等[4]研究證明食草動物傷害后以及應用茉莉酸后的西紅柿可以誘導產生揮發性物質；Arimura G[5]研究還認為已蟲害的豆科植物散發的揮發性物質觸發了鄰近植物葉片中編碼與發病機理相關的蛋白質和苯基丙氨酸氨裂解酶基因的轉錄，這個發現表明未受損傷的豆科植物可能是對揮發性物質信號的應答。馬尾松毛蟲（Dendrolimus punctatus）是我國南方造林樹種馬尾松（Pinus massoniana）的優勢害蟲，具有周期性暴發的規律[6]。胡永建等[7]用TCT-GC/MS分析了馬尾松、濕地松揮發性有機化合物的晝夜節律變化，結果表明：馬尾松晝夜節律中檢測到的揮發物主要是萜烯類化合物，其中單萜種類最多，且α-蒎烯和β-蒎烯含量約占整個揮發物的 80%，其次是含氧化合物等。任琴等[8]分別對野外及盆栽蟲害馬尾松針葉揮發物的時序變化進行了研究，研究結果表明：受害針葉萜烯類化合物多數在1 h后升高。胡永建等[9]用GC/MS分析了鄰枝針葉不同時間序列中茉莉酸甲酯的含量，結果表明蟲害馬尾松鄰枝針葉1 h茉莉酸甲酯含量就有所升高，2 h顯著高于對照（為對照的近1倍），證明馬尾松受到蟲害后，啟動了體內的防御系統，并誘導鄰枝產生抗性。茉莉酸甲酯被認為是受傷害植物誘導防御基因表達所必不可少的信號物質[10]。王勇等[11]對9種馬尾松樹針葉揮發性物質對松毛蟲赤眼蜂的嗅覺行為反應，確定了α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、α-萜品醇乙酸酯4種對松毛蟲赤眼蜂有影響活性的馬尾松樹針葉揮發性物質，其中尤以α-蒎烯和β-蒎烯2種物質作用最顯著。據Boeve J L等[12～14]的研究表明：植物被昆蟲咬食后，其局部和系統部位都會發生相應反應，但受害馬尾松誘導鄰近植株產生抗蟲性的研究未見報道。本研究采用GC/MS對馬尾松蟲害植株與相鄰健康株的揮發物進行了初步分析，旨在探討蟲害馬尾松對鄰近植株的揮發性物質是否具有誘導效應，研究結果初步表明受害馬尾松體內的揮發物較對照明顯增加，同時可以誘導鄰近植物產生防御反應，這為進一步闡明植物的防御策略提供了理論依據。

1 材料和方法

1.1 植物材料

在桐廬縣城關鎮實驗林場和杭州留下鎮小和山林場試驗基地各選擇有松墨天牛（Monochamus alternatus）蟲害的馬尾松林樣地，然后在樣地里分別選擇新枯死并有松墨天牛危害的馬尾松與鄰近（3 ～ 4 m）健康馬尾松進行采樣，并以樣地無蟲害馬尾松林中的健康株為對照。

1.2 馬尾松主干樹皮的采集

在樣地中選擇具有代表性的蟲害馬尾松、鄰近健康馬尾松及其無蟲害樣地馬尾松林中的健康植株按照上述采樣點采集樣品（在樹干韌皮部上、中、下部采樣，各部高度分別為5、3、1 m），樣本大小為20 mm×20 mm ×1 mm，樣品帶回實驗室后置于-18℃冰箱中保存，用于揮發性物質的測定。

1.3 揮發物的HS/SPME-GC/MS檢測

1.3.1 預處理 從冰柜中取出樣品，在25℃的水浴中迅速解凍，精密稱取1 g樣品置于15 mL頂空瓶中，加入2.4 g NaCl（30%）溶液以促進香氣成分的揮發，加入磁轉子，立刻用PTFE/硅橡膠隔墊密封壓緊。全部樣品于50℃磁力攪拌器中平衡15 min，將老化后的PDMS/DVB/CAR萃取頭插入樣品瓶頂空部分于50℃吸附20 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于260℃解吸3 min，同時啟動儀器采集數據。

1.3.2 儀器的工作條件 GC/MS型號Agilent5975，HP-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.33 μm)；程序升溫:起始溫度40℃，保持2.5 min，以10℃/min的速度升溫至200℃，保持6 min，檢測器（FID）溫度為250℃，進樣口溫度230℃，載氣為氦氣，流速1.0 mL/min。質譜接口溫度為260℃，離子源溫度200℃，電離方式EI，離子能量70 ev，掃描質量范圍為33 ～ 450 amu。

1.3.3 揮發性物質的鑒定 數據處理采用BF2002色譜工作站軟件，通過計算機檢索與NIST05質譜庫提供的標準質譜圖對照，選擇匹配度大于800的鑒定結果。

2 結果與分析

2.1 受害較嚴重區域蟲害馬尾松與相鄰健康株主干樹皮揮發物的比較

在馬尾松受害較為嚴重的區域桐廬市城關鎮實驗林場，選擇有蟲害的馬尾松林樣地，然后在樣地中分別選擇有代表性的蟲害馬尾松、鄰近健康馬尾松和無蟲害馬尾松林中的健康株采集樣品，采用HS/SPME-GC/MS分析受害馬尾松與相鄰健康主干樹皮揮發物的變化情況，結果見表1。從表1可知，受害馬尾松主干樹皮揮發物的主要成分是萜烯類化合物，分別是1R-α-蒎烯、β-蒎烯、α-水芹烯、β-月桂烯、D-檸檬烯、石竹烯等，其次是十一烷和十二烷、十氫-4，8，8-三甲基-9-次甲基-1，4-亞甲基奧、2-乙烯基-萘等；從表1還可以看出：相鄰健康株（與蟲害植株相鄰的健康株）其揮發性物質在種類及數量上明顯少于蟲害植株，也明顯少于對照（無病區馬尾松），即在蟲害較為嚴重的區域，蟲害前馬尾松的揮發性物質處于抑制狀態，蟲害后則釋放大量的揮發性物質并誘導鄰近植株產生抗蟲性。

表1 桐廬市蟲害馬尾松與相鄰健康株主干樹皮揮發物的比較Table1 VOCs from the damaged pine tree trunk and neighboring healthy one in Tonglu

2.2 蟲害較輕區域蟲害馬尾松與相鄰健康株主干樹皮揮發物的比較

在馬尾松受害較輕的區域杭州市西湖林場，選擇有蟲害的馬尾松林樣地，然后在樣地中分別選擇有代表性的蟲害馬尾松、鄰近健康馬尾松和無蟲害馬尾松林中的健康株采集樣品，采用HS/SPME-GC/MS分析受害馬尾松與相鄰健康主干樹皮揮發物的變化情況，結果見表2。從表2可知，蟲害馬尾松主干樹皮揮發物的主要成分是萜烯類化合物，分別是1R-α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、β-水芹烯、石竹烯和α-石竹烯等，其次是十一烷和十二烷、樟腦萜、十氫-4，8，8-三甲基-9-次甲基-1，4-亞甲基奧、2-乙烯基-萘等；從表2中還可以看出，蟲害馬尾松、相鄰健康株與對照（無病區馬尾松）的揮發性物質（除蒎烯外）在種類上差異不明顯，而相鄰健康株主干樹皮中的揮發性物質1R-α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯的含量則明顯高于蟲害馬尾松和對照。因而我們認為1R-α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯很可能是主要的信號傳遞物質。

表2 西湖林場蟲害馬尾松與相鄰健康株主干樹皮揮發物的比較Table 2 VOCs from the damaged pine tree trunk and neighboring healthy one in Hangzhou

3 結論與討論

植物株內和株間存在著防御信息的交流，而這種信息傳遞的介質則是受傷植物釋放出的揮發性化合物[15～18]。鄧文紅等[19]研究表明采用茉莉酸甲酯和萜烯混合熏蒸能夠代替蟲害等外界傷害的刺激，使馬尾松啟動相似的信號防御系統，達到防御外界傷害的作用，因而茉莉酸甲酯和萜烯可作為馬尾松響應傷害的報警信號。本研究中α-蒎烯和β-水芹烯在健康植株中含量的明顯變化（蟲害較輕區域）也證明了這一點。

鄧文紅等研究蟲食與熏蒸對馬尾松揮發性化學物質的影響時發現，蟲害和熏蒸處理后，水芹烯的相對含量在損傷枝、姊妹枝、系統上枝和系統下枝中均明顯高于對照；β-蒎烯相對含量在損傷枝和姊妹枝中升高，而系統枝條中下降；α-蒎烯相對含量在所測 4個部位中除熏蒸后系統下枝升高外其余全部降低。本次研究結果也證明，在蟲害較輕的區域，蟲害馬尾松、相鄰健康株與對照（無病區馬尾松）的揮發性物質（除蒎烯外）在種類上差異不明顯，而相鄰健康株主干樹皮中的揮發性物質1R-α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯含量則明顯高于蟲害馬尾松和對照，這與鄧文紅等的研究結果基本一致。

另外馬尾松在蟲害前后其揮發性物質呈現出先抑后揚的變化規律，即在蟲害較為嚴重的區域，相鄰健康株（與蟲害植株相鄰的健康株）的揮發性物質在種類及數量上明顯少于蟲害植株，也明顯少于對照，蟲害前馬尾松的揮發性物質處于抑制狀態，蟲害后則釋放大量的揮發性物質并誘導鄰近植株產生抗蟲性；而在蟲害較輕的區域中，蟲害馬尾松、相鄰健康株與對照（無病區馬尾松）的揮發性物質（除蒎烯和水芹烯外）在種類和數量上差異不明顯。因此本研究結果證明：馬尾松在植物株間存在著防御信息的交流，這種信息傳遞的介質可能是蟲害后傷口釋放出的揮發性化合物。然而蟲害植株向鄰近植株傳遞的最主要的信號物質是否為 1R-α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯還有待于今后進一步證實，揮發性物質的具體調節機制也尚未明了，有待于今后作進一步研究。因此，今后將進一步從分子機理上闡明植物防御反應的相關機制，找出參與植物通訊的有效信號分子。

[1] De Moraes C M, Mescher M C, Tumlinson J H. Caterpillar-induced nocturnal plant volatiles repel conspecific females[J]. Nature, 2001（410）：577-580.

[2] Aharoni A P, Giri A, Deuerlein S, et al. Terpenoid Metabolism in Wild-Type and Transgenic Arabidopsis Plants[J]. Plant Cell, 2003（15）：2 866-2 884.

[3] Arimura G, Ozawa R, Shimoda T, et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves[J]. Nature, 2000（406）：512-515.

[4] David C Degenhardt, Sarah Refi-Hind, Johannes W, et al. Systemin and jasmonic acid regulate constitutive and herbivore-induced systemic volatile emissions in tomato, Solanum lycopersicum[J]. Phytochemistry, 2010，71（17～18）：2 024-2 037.

[5] Arimura G, Ozawa R, Horiuchi J I, et al. Plant-plant interactions mediated by volatiles emitted from plants infested by spider mites[J]. Bioch Syst Ecol, 2001，29（10）：1 049-1 061.

[6] Ronald F Billings. The pine caterpillar Dendrolimus punctatus in Viet Nam; Recommendations for integrated pest management[J]. For Ecol Manag，1991（39）：97-106.

[7] 胡永建，任琴，金幼菊. 馬尾松、濕地松揮發性化學物質的晝夜節律釋放[J]. 生態學報，2007，27（2）：565-570.

[8] 任琴，李鎮宇，胡永建，等. 2005. 受害馬尾松、濕地松揮發性化學物質的釋放[J]. 生態學報，2005，25（11）：2 928-2 932.

[9] 胡永建，任琴，李鎮宇，等. 蟲害馬尾松（Pinus massoniana Lamb）鄰枝針葉揮發物及其內源茉莉酸甲酯的快速變化[J]. 生態學報，2008，28（11）：5 331-5 336.

[10] Claus Wasternack, Irene Stenzel, Bettina Hause, et al. The wound response in tomato-Role of jasmonic acid[J]. J Plant Physiol，45（6）：2006，163（3）：297-306.

[11] 王勇，肖鐵光，何忠，等. 馬尾松樹針葉揮發性化學物質對松毛蟲赤眼蜂嗅覺及寄生行為的影響[J]. CN Bull Entomol，2008，944-949.

[12] Boeve J L, Lengwilor U, Tollsten L. Volatiles emitted by apple fruitlets infested by larvae of the European apple sawfly[J]. Phytochemistry，1996, 42（2）：373-381.

[13] Baldwin L T, Kessler A, Ualitscke R. Volatile signaling in plant-plant-herbivore interactions: what is real?[J]. Current Opini Plant Biol, 2002, 5（4）：351-354.

[14] Zeng-guang Yan, Chen-zhu Wang. Wound-induced green leaf volatile cause the release of acetylated derivatives and a terpenoid in maize[J]. Phytochemistry, 2006, 67(1): 34-42.

[15] Sjoerd Van der Ent, Saskia C M Van Wees, Corné M J Pieterse. Jasmonate signaling in plant interactions with resistance-inducing beneficial microbes[J]. Phytochemistry, 2009, 70(13～14): 1581-1588.

[16] Margit Leitner, Roland Kaiser, Martin O Rasmussen, et al. Microbial oligosaccharides differentially induce volatiles and signaling components in Medicago truncatula[J]. Phytochemistry, 2009, 69(10): 2 029-2 040.

[17] Appelgryn J J, Visser B. Evidence for volatile signalling between leaf-rust infected and uninfected wheat[J]. South Af Bot, 2008, 74(2): 360.

[18] Kyutaro Kishimoto, Kenji Matsui, Rika Ozawa, et al. Analysis of defensive responses activated by volatile allo-ocimene treatment in Arabidopsis thaliana[J]. Phytochemistry，2006, 67（14）：1 520-1 529.

[19] 鄧文紅，沈應柏，陳華君，等. 蟲食與熏蒸對馬尾松揮發性化學物質的影響[J]. 西北植物學報，2008，28（12）：2 547-2 551.

Preliminary Study on Changes in Volatile Compounds from Damaged Pinus massioniana Trunk and the Neighboring Healthy One

WANG Li-xia1，XU Zhi-hong1*，CHEN Wei-min2，SUN Pin-lei2，WU Dong-jiang2，YU Chun-lai3，BAO Chun-quan4
（1. School of Agriculture and Food Science, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 2. Hangzhou Forest and Wild Animal Conservation Station of Zhejiang, Hangzhou 310009, China; 3. Chun’an Forest Pest Control and Quarantine Station of Zhejiang, Chun’an 311700, China; 4. Tonglu Forest Pest Control Station of Zhejiang, Tonglu 311500, China）

The composition and content of volatile organic compounds (VOCs) from damaged Pinus massioniana trunk and that from neighboring healthy one and the control was analyzed by HS/SPME/GC/MS. The results showed that major composition of VOCs from damaged tree was terpenes. Types and content of VOCs from damaged trees were evidently lower than that from the control. While types and content of VOCs from neighboring healthy trees were significantly higher than that from the control.

Pinus massoniana; neighboring tree; volatile organic compounds

S763.3

B

1001-3776（2013）06-0051-06

2013-07-01；

2013-10-08

“松材線蟲病疫木除害和松褐天牛綜合控制技術”杭財預〔2008〕144號、杭財預〔2009〕111號

王麗霞（1967-），女，浙江平湖人，副教授，博士，從事林產化工加工研究；*通訊作者。