RON蛋白在正常胚胎食管組織發育成熟過程及腫瘤組織中的表達特征

陸 意 黃閩杰 張占春 浙江省寧波市醫療中心李惠利腫瘤放化療科 寧波 315000沈 玲 姚航平 浙江大學醫學院附屬第一醫院傳染病診治國家重點實驗室

·論 著·

RON蛋白在正常胚胎食管組織發育成熟過程及腫瘤組織中的表達特征

陸 意 黃閩杰 張占春 浙江省寧波市醫療中心李惠利腫瘤放化療科 寧波 315000沈 玲 姚航平 浙江大學醫學院附屬第一醫院傳染病診治國家重點實驗室

目的：探討原癌基因RON在正常胚胎食管組織發育成熟及腫瘤組織中的表達特征及臨床意義。方法：采用高密度組織芯片和免疫組化染色方法，檢測RON在正常胚胎食管組織、成人食管組織和食管腫瘤組織中的表達及分布，半定量方法計算RON表達水平，分析比較差異。通過免疫印跡Western-blot法和RT-PCR法檢測食管癌與正常食管組織中RON蛋白和基因的表達水平。結果：RON在正常胚胎食管與成人食管組織中的表達和分布差異無統計學意義（P＞0.05）。RON在食道癌組織中呈高表達（P＜0.05），其中12.5%食管癌組織中RON呈過度表達，且主要表達在食管癌細胞膜，而正常胚胎食管組織呈極弱或低表達。結論：RON在胚胎食管組織發育和成熟過程中穩定表達；RON的異常表達與食管癌的發生、進展密切相關。

食管癌 酪氨酸激酶受體RON 病理機制 組織芯片

原癌基因RON是屬于MET原癌基因家族成員之一，成熟的RON蛋白是一種跨模型蛋白受體，主要表達在上皮組織中，發揮傳導細胞內外信號的生物學效用[1]。研究發現，RON的異常表達是導致胃腸道上皮細胞惡性轉化的一個致病因子[2-3]。我國是食管癌的高發國家，也是死亡率最高的國家，多數患者就診時已屬中、晚期。近年來生物靶向藥物逐漸應用于惡性腫瘤的治療[4]，關于原癌基因RON與食管癌的關系值得研究。為了深入、全面地研究RON在食管上皮組織生理、病理中的作用，明確RON的表達、分布及致病機理，本研究擬通過組織芯片、免疫組織化學方法定性檢測正常胚胎食管組織發育成熟過程及腫瘤組織中RON的表達和分布情況，采用Western blot和RT-PCR法定量分析RON在食管癌鱗狀上皮組織中的表達；探討RON與正常食管組織、腫瘤組織的關系，揭示食管癌發生的具體分子機制，為進一步研究食管癌和臨床診斷、放化療、生物靶向治療等提供理論基礎。

1 實驗材料

正常胚胎食管組織、成人食管組織的組織芯片購于CYBRDI（www.cybrdi.cn，陜西）。組織芯片中包含正常胚胎組織38例，3～8月齡；正常成人組織40例，平均年齡54.7歲，均為男性；食管癌組織80例，平均年齡57.3歲，均為男性，病理類型均為鱗癌。

食管癌組織及正常食管組織新鮮標本：食管癌組織取自2011年1月—2011年12月寧波市李惠利醫院的手術切除標本，共20例，均為男性，年齡50～65歲，平均58.6歲，術前均未行輔助治療，經病理證實為食管癌。正常食管組織取自正常人內鏡活檢標本，共15例，均為男性，年齡50～60歲，平均55.2歲。兩組性別構成及年齡分布差別均無統計學意義（P＞0.05）。上述組織均為離體后30min內取材，立即放入液氮罐，并轉入-80℃冰箱保存直至檢測。所有組織樣本的使用均經患者同意并獲倫理委員會批準。

2 實驗方法

2.1 免疫組織化學染色分析食管組織RON蛋白表達 組織芯片在60℃烤箱中烤2h，然后經脫蠟、水化、抗原修復、3%BSA封閉后，加鼠抗人RON單克隆抗體Zt/g4[5]（1：1000 in PBS），室溫孵育2h，PBS洗片后加生物素化的二抗及SABC酶復合物（鏈霉親和素－過氧化物酶復合物，武漢博士德公司產品），室溫反應30min，洗片后用DAB顯色，蘇木素復染，經脫水、透明、封片，最后用奧林帕斯CKX41型顯微鏡觀察組織染色情況并拍照。結果判斷：陽性定位，RON蛋白主要表達于細胞膜上，呈棕黃色顆粒。定性：觀察5個400×高倍視野，陽性染色的細胞數量≤5%為陰性，＞5%為陽性。通過半定量方法[6]，計算免疫組化評分，統計分析比較差異。

2.2 Western-blot法檢測食管組織RON蛋白表達

準確稱取新鮮食管組織并絞碎，使用組織裂解液（150mM NaCl，10mM Tris-HCl pH7.9，0.5%TritonX-100，0.6%NP-40，andprotease inhibitors，1μg/mL leu?peptin，1ug/mL pepstatin A，and 2μg/mL aprotinin）按每10mg組織加300μL裂解液冰上裂解30min后，離心取上清液，用BCA蛋白定量試劑（Bio-Rad）檢測蛋白質濃度。取40μg蛋白樣本加入2×SDS上樣緩沖液煮沸5min，以10%的聚丙烯酰胺凝膠泳后轉移至PVDF膜（Bio-Rad），用封閉液（含7.5%脫脂奶粉，2%BSA，0.1%Tween-20的PBS）封閉1h后，加入RON抗體R5029[3]（1：5000）4℃過夜。用洗滌緩沖液（含0.1%Tween-20 PBS）洗膜3次，加入過氧化物酶交聯的羊抗鼠IgG（Pierce，用封閉液1:10000稀釋）室溫下作用1h，PBS洗膜后，使用ECL化學發光試劑（美國Amersham公司）顯影，全自動熒光化學發光成像儀成像。顯影結束后，膜用抗體洗脫液（Re-blot，美國Chemicon公司）室溫孵育20min，封閉液封閉30min后，同法用兔抗人actin抗體（美國Santa Cruz）反應作內參。

2.3 RT-PCR檢測食管組織RON基因表達 收集各食管癌和正常食管組織，用Trizol（美國Gibco公司）常規提取總RNA，經核酸蛋白紫外分析儀（Beckman DU640）檢測，A260與A280比值為1.75～1.80。取2μg總RNA于42℃逆轉錄（逆轉錄試劑盒為MBI Fermentas公司產品）1h后，以β-actin作為內參照，進行半定量聚合酶聯反應（PCR）擴增。RON引物（擴增產物153bp）上游：5-ATCCACCCAGTGC?CAACCTAGTT-3，下游：5-GCAGCAGGATACCAAGG AGCGT；β-actin引物（擴增產物619 bp）上游：5-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3，下游：5-GTCAC?GCACGATTTCCCGCT-3。引物均由上海生物工程有限公司合成。PCR反應條件：95℃預變性3min；94℃變性30s，60℃復性30s，72℃延伸1min，擴增28個循環；72℃延伸10min。取10μLPCR產物電泳，用數碼凝膠圖像分析系統（BioRad GelDoc）作條帶密度掃描。根據目的基因RON與相應β-actin的密度比值確定基因的表達水平高低。

2.4 統計學方法 應用SPSS11.0統計軟件，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 RON在正常胚胎食管組織和成人食管組織的表達 食管組織中RON以中-低水平表達為主，主要以鱗狀細胞和柱狀細胞為主。胚胎與成人食管組織中RON的表達非常接近。RON在胚胎與成人食管組織中表達差異無統計學意義（P＞0.05）。提示RON在食管甚至整個消化系統的胚胎發育和成熟過程中穩定表達，證實RON作為原癌基因在胚胎發育中的作用，見表1，圖1。

表1 RON蛋白在正常胚胎食管與成人食管組織的表達（）

表1 RON蛋白在正常胚胎食管與成人食管組織的表達（）

組別n/例 陽性分布 表達量 總分胚胎食管成人食管38 40 1.1±0.8 2.2±0.3 2.5±0.4 1.3±0.2 3.6±1.2 3.5±0.5

圖1 正常食管組織RON蛋白免疫組織化學染色（×400）A：正常胚胎食管組織； B：正常成人食管組織

3.2 RON在食管癌組織中的表達和分布 通過免疫組化方法檢測食管癌組織中RON的表達。評分＞6分為過度表達，圖2顯示RON在食管腫瘤組織中典型的過度表達。在腫瘤細胞的胞膜和胞漿中都可見到高濃度的染色，尤以細胞膜為主。80例食管癌組織的RON蛋白陽性表達率85%，其中食道癌中RON過度表達為12.5%，相應正常食管組織陽性率＜8%。食管癌組織RON蛋白陽性表達率顯著高于相應正常食管組織的表達（P＜0.05），提示RON與食管癌之間存在密切的關系，見表2，圖2。

表2 RON蛋白在食管鱗癌和正常食管組織表達（±s） 例

表2 RON蛋白在食管鱗癌和正常食管組織表達（±s） 例

注：與正常組織比較，*P＜0.05

組別鱗癌組織正常組織n 80 40陰性12 37陽性68 3陽性表達量4.4±0.5* 3.5±0.5陽性率/% 85.0 7.5強陽性10 0強陽性率/% 12.5 0

圖2 食管組織RON蛋白免疫組織化學染色（×400）A：正常食管組織標本，RON呈弱表達。B：食管癌組織標本，食管癌細胞胞膜上可見大量的明顯棕黃色顆粒，RON呈強陽性表達。

3.3 Western-blot檢測食管癌組織與正常食管組織RON蛋白表達 第2、3、4、5列的食管癌組織樣本中可見兩條高密度陽性條帶，一條是RON的前體蛋白（pro-RON），分子量為180kD，另一條是成熟RON的β鏈（RON-βchain），分子量約為160kD，與第1列陽性對照（轉染了RON基因的3T3細胞）一樣。第6、7、8、9列的正常食管組織中RON僅呈極低表達。證明RON蛋白表達水平在食管癌中顯著高于正常組織。不同腫瘤病理類型的組織標本中RON蛋白表達水平也存在一定差異，其中第2、3、5列是食管鱗癌，第4列是食管賁門腺癌，但由于樣本數少，無法做統計學分析，將做進一步研究，見圖3。

圖3 食管癌及正常食管組織RON蛋白表達

3.4 PT-PCR檢測食管癌組織與正常食管組織RON基因表達 食管癌組織RON基因表達顯著高于正常食管組織，與RON蛋白表達改變一致，見圖4。

圖4 食管癌及正常食管組織RON基因表達

4 討論

受體酪氨酸激酶RON在上皮性腫瘤中的作用日益被重視。研究發現[7]，RON在調節消化道上皮細胞的增殖、遷移中發揮重要作用。RON基因在正常消化道組織中的轉錄和表達是穩定的，也是保守的[6，8]。有研究[6]顯示RON在正常食管和相應的癌癥中的表達和分布情況。本研究數據亦顯示RON在食管上皮細胞的胚胎發育成熟過程中都有所表達，該結果與動物研究RONmRNA的表達一致[9]。RON在胚胎發育過程中是必需的，本研究進一步證明RON作為原癌基因的生理及病理意義。如圖1所示RON在胚胎食管組織黏膜表面的鱗狀上皮細胞呈中等表達。細胞膜和細胞質都被染色。其中管腔隱窩底部的細胞染色相對較淡。這些表達模式與在成人組織中發現的比較類似，表明兩者有類似的機制調節RON基因轉錄和蛋白質合成。而在食管癌組織中陽性染色主要位于細胞膜，與正常胚胎、成人組織的表達模式不同。本研究還證實了先前的結果，在胃腸道上皮細胞癌的腫瘤發展過程中存在RON異常表達[2-3，6，8]。此外，研究還發現，胃腸道腫瘤之間RON過度表達的比率有很大的不同。如本文圖2和表2所示食道癌中RON過度表達的比率為12.5%。RON的異常表達往往導致侵襲活性的增加，因此RON的表達情況可能影響腫瘤的進展和預后。

免疫組織化學檢測RON的結果顯示，食管癌細胞胞膜上見大量的明顯棕黃色顆粒；而在正常食管組織中，幾乎少見明顯棕黃色顆粒。食管癌組織RON蛋白陽性表達率顯著高于相應正常食管組織的表達。免疫印跡Western-blot和RT-PCR法檢測結果進一步顯示食管癌組織RON蛋白表達水平顯著高于正常食管組織。這些都表明RON在正常食管發育成熟中表達，而且與食管癌的進展存在一定的關系，但是究竟RON的表達增高參與食管癌的發生、發展，還是食管癌誘導RON表達提高，仍待研究。①RON作為原癌基因，對人體正常生長發育有不可或缺的作用，但是在某些外界因素的影響下，可以被異常激活或誘導，轉變為癌基因。②RON參與炎癥反應。研究表明，RON能抑制參與炎癥反應的炎癥因子表達。已知食管癌可能與上皮腸化生、反流性食管炎有關。當RON表達增高時，可抑制炎癥因子發揮作用，從而抑制炎癥反應，致使炎癥得以持續感染食管上皮細胞，最終誘發癌變。③RON作為一種細胞膜受體，在某些外因作用下，能被誘導或促進RON表達增高，同時促進相關信號途徑的傳導，激活下游蛋白，異常活化某些基因。本研究還發現并非所有食管癌組織中RON都表達陽性，且陽性表達水平高低也不盡相同，這與食管癌的組織病理類型、腫瘤分期有著很大的關系，有待于進一步研究。因此，RON與食管炎的關系、食管癌具體病理分型與RON的關系及食管癌組織中RON變異體的表達情況等等都是今后的研究方向之一。在臨床上，通過免疫組織化學法和免疫印跡法檢測RON的表達可以作為食管癌診斷的手段之一。RON的生物靶向治療也將是食管癌治療的發展方向之一。

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Exp r ess i ono f RONi n t heDeve l opmen t o f Emb r yon i c Esophagus Ti ssueand Esophagea l Cance r

LUYi，HUANGMinjie，ZHANGZhanchun，etal.OncogenicRadiotherapyCenter,NingboMedicalTreatmentCenter Lihuil i Hospital,Ningbo(315000),China

Objective:To investigate the expression of receptor tyrosine kinase RON in the development and pro?gression of esophagus tissue and its clinical significance.Methods:Tissue microarraies were used to detect the expression and location of RON in esophageal normal tissue and cancer tissue by immunohistochemical staining，western-blot,and RT-PCR.Results:No significant difference in RON protein was noted between embryonic tis?sue and adult tissue(P＞0.05).The expression level of RON protein in esophageal cancer significantly exceeded normal tissue and RON mostly located in the membrane of esophagus cells,while normal esophagus tissue hardly or lowly expressed RON protein.Conclusion:RON expressed stably in the esophagus embryonic development and maturation process;meanwhile,RON is related with the onset and progression of esophageal cancer.

esophageal cancer receptor tyrosine kinase RON pathomechanism tissue microarray

2012-11-07

修回日期：2012-12-10

浙江省科技計劃項目（No.2009C33150）

姚航平，Tel：0571-87236580；E-mail：yaohangping@126.com