大鼠背根神經節ERK5/CREB信號通路在神經病理性疼痛中的作用

肖 純 孫建良 浙江省嘉興市第一醫院麻醉科 嘉興 314000

盧 波 姚 娟 溫州醫學院附屬第二醫院（育英兒童醫院）麻醉科

·實驗研究·

大鼠背根神經節ERK5/CREB信號通路在神經病理性疼痛中的作用

肖 純 孫建良 浙江省嘉興市第一醫院麻醉科 嘉興 314000

盧 波 姚 娟 溫州醫學院附屬第二醫院（育英兒童醫院）麻醉科

目的：探討脊髓與背根神經節（DRG）細胞外信號調節蛋白激酶5（ERK5）信號通路在神經病理性疼痛中的作用。方法：SD大鼠坐骨神經結扎（CCI）建立神經病理性模型。應用免疫組化方法檢測CCI大鼠DRG磷酸化ERK5（p-ERK5）表達的變化；鞘內注射ERK5反義寡核苷酸對CCI大鼠DRG p-CREB表達以及機械縮足反射閾值（MWT）和熱縮足反射潛伏期（TWL）的影響。結果：CCI大鼠同側DRG p－ERK5標記的神經元數量明顯增加；鞘內注ERK5反義寡核苷酸有效抑制DRG ERK5表達的同時，CCI所致的p-CREB表達上調（P＜0.05）、機械與熱痛覺過敏也明顯減輕（P＜0.05）。結論：DRG ERK5參與了神經病理性疼痛的信號轉導過程，其部分作用是通過激活轉錄因子CREB實現的。

大鼠 坐骨神經結扎 神經病理性疼痛 背根神經節 細胞外信號調節蛋白激酶5 cAMP反應原件結合蛋白

神經病理性疼痛是困擾人類健康的嚴重問題，目前其發生機制尚未完全闡明，臨床治療效果亦不理想。背根神經節（dorsal rootganglion，DRG）細胞是初級感覺傳入神經元，在神經病理性疼痛的發生發展過程中起重要作用[1]。細胞外信號調節蛋白激酶5（extracellular-signal regulated protein kinase 5，ERK5）是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein ki?nases，MAPKs）家族的新成員，研究發現ERK5在DRG的活化參與了炎癥性疼痛與神經病理性疼痛的信號轉導，但其機制尚不清楚[2-3]。本研究擬通過觀察坐骨神經結扎（CCI）大鼠DRG磷酸化ERK5（p-ERK5）的表達變化，及其對轉錄因子CREB（cAMP response elementbinding protein）活性的調節作用，探討其在神經病理性疼痛中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠，體質量220～250g，由浙江省實驗動物中心提供。

1.2 動物分組 實驗分三部分進行。第一部分，32只大鼠隨機分為坐骨神經結扎組（CCI組）與假手術組（Sham組），每組16只。坐骨神經結扎組大鼠參照Xie[4]的方法行坐骨神經結扎建立神經病理性疼痛模型；假手術組僅暴露坐骨神經但不結扎。于術前1天，術后1、4、7天各處死4只大鼠取材行免疫組化試驗，觀察大鼠背根神經節p-ERK5的表達變化。

第二部分，共60只大鼠，參照Yaksh等[5]描述的方法行鞘內置管。于坐骨神經結扎前36、24、12h，通過導管行鞘內給藥，按鞘內所給藥物不同隨機分為ERK5反義寡核苷酸組（AS組）、ERK5錯義寡核苷酸組（MM組）與生理鹽水組（NS組），每組20只。其中48只大鼠于術前1天，術后1、4、7天各處死4只取材行免疫組化試驗，觀察大鼠背根神經節p-CREB的表達變化；其余12只大鼠，鞘內給藥后不行坐骨神經結扎，于鞘內給藥后12h處死取材行免疫印跡實驗，測定背根神經節ERK5含量，評估反義寡核苷酸對ERK5表達的抑制效果。

第三部分，24只大鼠隨機分為三組，每組8只，分組與處理同第二部分。于坐骨神經結扎前1天，術后1、4、7天進行行為學實驗。

1.3 免疫組織化學 動物戊巴比妥鈉（60mg/kg，腹腔注射）深麻醉下，經升主動脈依次灌注4℃生理鹽水 100mL、4%多聚甲醛 400mL（0.1mol/L PB，pH7.4）。取同側L4、L5DRG置于多聚甲醛后固定3h后，移至30%蔗糖脫水至組織沉底。冰凍冠狀切片，片厚25μm。切片經0.01M的PBS沖洗3次，與0.3% H2O2、10%山羊血清孵育后，加入山羊抗p-ERK5抗體（1:200，Santa Cruz公司美國）孵育，4℃過夜。按SP法進行免疫組織化學染色，DAB顯色。

1.4 免疫印跡 動物在戊巴比妥鈉（60mg/kg，腹腔注射）麻醉下處死，迅速取同側L4、L5DRG移至液氮保存。將組織在預冷的蛋白質抽提緩沖液（10mM HEPES，1mM Na3VO4，1.5mM MgCl2，10mM KCl，50mM NaF，0.1mM EDTA，0.1mM EGTA，0.5mM Phenylmethylsulfonyl fluoride，1mM Dithiothreitol， 0.02%cocktail，pH 7.9）中勻漿，加入90μL10%NP-40劇烈震蕩30s，4℃14000g離心15min，吸取上清液。Bradford法測定樣本蛋白濃度，加入4倍樣本緩沖液（mM:Tris-HCl 250，蔗糖 200，Dithiothreitol 300，0.01%考馬斯亮蘭-G和8%SDS，pH 6.8），95℃水浴5min。取等量30μg樣本加至10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳，壓縮膠80V，分離膠150V。半干法轉移至硝酸纖維素膜。3%牛血清封閉3h。加兔抗ERK5抗體（1:500，Cell Signaling Technology公司，美國），4℃孵育過夜。TBST沖洗，加入堿性磷酸酶標記的山羊抗兔二抗（1:10000），室溫搖床孵育1.5h，TBST沖洗，NBT/BCIP檢測反應條帶。

1.5 鞘內給藥 在異氟醚吸入麻醉下使用微量注射器行鞘內給藥。根據分組不同，分別在坐骨神經結扎前36、24、12h鞘內注射10nmol/10μLERK5反義寡核苷酸（溶于生理鹽水），或相同劑量的錯義寡核苷酸或生理鹽水。ERK5反義及錯義寡核苷酸采用Nadruz[6]設計的序列，由上海生工生物技術有限公司合成并進行硫代磷酸化修飾，反義序列：5'-GCC?GCCGCCGCCGCCAT-3'，錯義序列：5'-CGCGC?GCTCGCGCACCC-3'。鞘內給藥時間大于30s，隨后用10μl生理鹽水沖洗導管。

1.6 行為學實驗 采用von Frey纖維按Chaplan[7]報道的方法測定大鼠左后足機械縮足反射閾值（MWT）。將大鼠于置透明的有機玻璃箱中，底為1cm×1cm的鐵絲網，測定前使之適應15min，以不同折力的Von Frey纖維（Stoehing公司，美國）刺激大鼠足底，從2g開始，以up-down法并在閾值上下刺激5次，計算50%縮足反應閾值，最大折力為15g，大于此值時記為15g。按Hargreaves[8]報道的方法測定熱縮足反射潛伏期（TWL）。用熱輻射刺激儀（10V，50W；光斑直徑為0.8cm，浙江大學國家光學儀器技術研究中心）照射大鼠足底，記錄照射開始至大鼠出現抬腿回避時間，每只動物測定3次，間隔3min，取平均值為TWL。

1.7 細胞計數與半定量分析 隨機選取各實驗動物L4～5DRG，高倍鏡下計算DRG陽性細胞數目；West?ern blot條帶用Adobe Photoshop軟件進行半定量分析。

1.8 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件，采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 坐骨神經結扎大鼠p-ERK5陽性的背根神經節神經元表達 術前坐骨神經結扎組與假手術組大鼠僅有少量背根神經節神經元表達p－ERK5；假手術組大鼠術后p－ERK5陽性背根神經節神經元數量無明顯改變（圖1-A）；與假手術組比較坐骨神經結扎大鼠p－ERK5陽性背根神經節神經元數量明顯增加（P＜0.05）（圖1-B、C）。坐骨神經結扎模型建立1天后p－ERK5陽性背根神經節神經元數量達峰值，p－ERK5陽性背根神經節神經元數量增加一直持續到實驗結束（7天）（圖1-C）。

圖1 CCI對DRG p-ERK5表達的影響

2.2 鞘內注射ERK5反義寡核苷酸對坐骨神經結扎術后DRG p-CREB表達的影響 各組基礎p-CREB陽性背根神經節神經元數量之間差異無統計學意義（P＞0.05）；坐骨神經結扎后各組大鼠p-CREB陽性背根神經節神經元數量均明顯增加，與MM組比較，AS組背根神經節p-CREB陽性背根神經節神經元數量明顯降低（P＜0.05）；生理鹽水組與MM組之間p-CREB陽性背根神經節神經元數量差異無統計學意義（P＞0.05）（圖2-A、B、C、E）。

Western blot結果顯示，與MM組比較AS組DRG與脊髓ERK5的含量明顯降低（＞70%）（P＜0.05）；生理鹽水組與MM組之間背根神經節與脊髓ERK5含量差異無統計學意義（P＞0.05）（圖2-D、F）。

2.3 鞘內注射ERK5反義寡核苷酸對坐骨神經結扎術后熱與機械痛敏的影響 各組基礎TWL和MWT之間差異無統計學意義（P＞0.05）。坐骨神經結扎術后各組TWL與MWT均低于基礎值，與MM組比較，AS組TWL與MWT升高（P＜0.05）；生理鹽水組與MM組TWL與MWT差異無統計學意義（P＞0.05）（圖3-A、B）。

圖2 鞘內注射反義寡核苷酸抑制ERK5表達對CCI大鼠DRG p-CREB表達的影響

圖3 鞘內注射反義寡核苷酸抑制DRG ERK5緩解CCI所致的熱與機械痛覺過敏

3 討論

神經系統的可塑性是神經病理性疼痛發生發展的關鍵機制，導致神經系統持久可塑性改變必需有基因表達水平的改變。傷害性傳入信號通過細胞信號轉導體系傳遞后，可激活多種轉錄因子，調節初級感覺和脊髓背角神經元基因的表達，從而產生病理性疼痛狀態下神經系統長時間的功能和結構變化[9]。

與其它MAPKs一樣ERK5信號通路采用高度保守的三級激酶級聯體系進行信號傳遞。被上游激酶磷酸化激活后，p－ERK5—ERK5的活化形式不僅催化多種胞漿蛋白磷酸化，而且迅速轉位進入核內直接或間接調節轉錄因子的活性，通過調節轉錄及轉錄后修飾發揮其生物學作用[10]。本研究中，外周神經損傷后DRG p-ERK5表達明顯增加，鞘內注射ERK5反義寡核苷酸抑制ERK5表達的同時，明顯減輕了CCI所致的機械和熱痛覺過敏反應，說明DRG ERK5的激活參與神經病理性疼痛的發展過程。

對ERK5信號通路的研究發現，p-ERK5核轉位后可調節多種轉錄因子的活性，包括MEF2C、CREB、NF-B、Fos、Zif268、Sap1等[10]。轉錄因子CREB由341個氨基酸殘基組成，CREB存在多個磷酸化位點，其中serine133的磷酸化是其發揮調節轉錄功能的基礎，p-CREB先與CREB結合蛋白（CBP）結合，再共同結合到靶基因上的特定序列CRE，即可募集RNA聚合酶Ⅱ組成轉錄復合體，調節靶基因的轉錄[11]。CREB結合位點CRE存在于許多疼痛相關基因的啟動子區域，包括c-fos、zif268、cox-2、NK-1、強啡肽、降鈣素基因相關肽、腦源性神經營養因子（brain-de?rived neurotrophic factor BDNF）等[12～14]。研究表明，CREB依賴的基因表達是傷害性刺激誘發的神經系統重塑所必須的，如突觸的長時程增強、交感神經芽生等。在本研究中鞘內注射ERK5反義寡核苷酸在減輕炎性痛的同時有效地抑制了CCI所致的DRG神經元CREB的磷酸化。因此，p－ERK5參與了神經損傷誘導所致的CREB活化過程，而ERK5的部分功能可能是通過調節CREB依賴的基因表達實現的。

傷害性刺激不僅能增強初級感覺神經元的興奮性，而且可增強中樞神經系統的興奮性，外周和中樞神經系統的敏感化都參與了痛覺過敏的產生和維持過程。Mizushima等[15]證實，ERK5在DRG的短暫（60min）活化僅參與了熱痛敏和外周敏感化產生，而與機械痛敏無關。本研究中，鞘內注射ERK5反義寡核苷酸大鼠CCI后熱和機械痛覺過敏均明顯減輕。導致機械痛敏的主要原因是中樞敏化。初級感覺神經元的傳入信號在中樞敏感化過程中同樣起重要的作用。許多神經遞質的編碼基因包含CRE，例如BDNF[12]。在神經病理性疼痛狀態下初級感覺神經元BDNF表達增加，并通過軸漿運輸轉運脊髓背角，進而調節脊髓神經元的興奮性。Obata等[3]證實背根神經節ERK5參與了BDNF表達的調節。因此，DRG中ERK5－CREB信號通路的活化可能通過突觸傳遞間接地參與中樞神經系統的敏感化過程。

綜上所述，DRG ERK5參與了神經病理性疼痛的信號轉導過程，其部分作用是通過激活轉錄因子CREB實現的。

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Activation of ERK 5/CREB Signaling Pathway in Dorsal Root Ganglia Contributes to Neuropathic Pain

XIAO Chun，LU Bo，YAO Juan，et al.Department of Anesthesiology,the First Hospital of Jiaxing,Jiaxing (314000),China

Objective:To explore the role of dorsal root ganglia(DRG)extracellular signal-regulated protein ki?nase 5(ERK5)signaling pathway in neuropathic pain.M ethods:Chronic constructive injury(CCI)model was made by loose ligation of sciatic nerve by chromic gut in male SD rat.The expression of p-ERK5 was investigat?ed in the DRG following ligation of sciatic nerve by using immunohistochemistry.To examine the functional con?sequences of ERK5 activation,the expression of p-CREB(cAMP response element binding protein)and hyperalge?sia response to nerve injury was test after intrathecal administrating ERK5 antisense oligonucleotides.Results:Li?gation of sciatic nerve produced sustained ERK5 activation in DRG.Knockdown of the ERK5 by antisense oligo?nucleotides suppressed the heat and mechanical hyperalgesia,and phosphorylation of CREB induced by peripher?al inflammation(P＜0.05).Conclusion:Activation of ERK5 DRG contributes to neuropathic pain by activating the transcription factor CREB.

extracellular signal-regulated protein kinase 5 neuropathic pain dorsal root ganglion cAMP re?sponse element binding protein

2012-07-30