姜黃素對非酒精性脂肪肝家兔肝組織TNF-α表達的影響

趙志光 周玲玲 林瓊瓊 周伶俐 溫州醫學院附屬第二醫院病理科 溫州 325000林梅瑟 浙江省溫州市中醫院ICU

姜黃素對非酒精性脂肪肝家兔肝組織TNF-α表達的影響

趙志光 周玲玲 林瓊瓊 周伶俐 溫州醫學院附屬第二醫院病理科 溫州 325000林梅瑟 浙江省溫州市中醫院ICU

目的：觀察姜黃素對非酒精性脂肪肝病（NAFLD）家兔的肝臟病理學變化及肝組織TNF-α表達水平的影響。方法：復制成功的NAFLD模型家兔34只隨機分為姜黃素組和模型組，各17只，均予基礎飼料喂養,治療組每天給予姜黃素200mg灌胃1次,模型組每天給予生理鹽水灌胃1次，治療1個月。免疫組織化學法分析TNF-α表達，觀察肝組織病理學變化。結果：姜黃素組TNF-α表達較模型組顯著降低（P＜0.05），肝炎癥活動及纖維化程度明顯好轉。姜黃素組TNF-α表達水平與肝炎癥活動度、纖維化呈正相關（P＜0.05）。結論：姜黃素可有效改善肝臟炎癥活動及纖維化程度，從而防治NAFLD。

非酒精性脂肪肝 腫瘤壞死因子α 肝纖維化 姜黃素

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的、以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變為主要特征的臨床病理綜合征。該病發病率逐年增高[1]，且研究表明是隱源性肝硬化的重要病因[2]，甚至可發展為肝癌[3-4]，但其發病機制尚不十分明確。目前臨床上藥物治療效果尚不理想。NAFLD發病基礎為脂質代謝紊亂及異常信號轉導通路的激活，包括脂質代謝異常及由此導致的異常細胞因子釋放，如脂質代謝調節因子PPAR、SREBP-1c等，促炎因子TNF-α、IL-6等，以及促纖維化因子α-SMA、TGF-β等。近年研究證實姜黃素有抗炎、抗氧化、抗凝血、降血脂、抗動脈粥樣硬化和抗腫瘤等作用[5]。本研究以高脂飼料飼養并建立NAFLD家兔模型，觀察姜黃素對家兔NAFLD的治療作用。

1 實驗材料

1.1 動 物 日本大耳白家兔50只，雄性，體質量1.8～2.2kg，2～3月齡，由溫州醫學院動物實驗中心提供，浙醫動字2200300002，并在該動物實驗中心飼養。高脂飼料組成:84%基礎飼料，10%豬油，5%紅糖，1%膽固醇（第二軍醫大學免疫學研究所）。

1.2 藥物及試劑 姜黃素由神威藥業有限公司提供。即用型TNF-α多抗購自福州邁新生物技術有限公司。

2 實驗方法

2.1 NAFLD模型復制 50只日本大耳白家兔給予基礎顆粒飼料適應性喂養1周。隨機選取10只家兔作為正常對照組繼續給予基礎飼料喂養，其余40只給予高脂飼料，單籠喂養，每天每兔進食量為150g，飲水不限。造NAFLD模型過程中兔子死亡2只，8周后隨機抽取4只家兔處死，NAFLD模型組與正常對照組相比，TG、TC和LDL-C都顯著升高，說明已經出現脂肪代謝紊亂;取肝組織病理檢查，4只家兔均表現出中-重度的脂肪變性，說明NAFLD模型成功建立。剩余34只NAFLD模型家兔隨機分成NAFLD模型組和姜黃素組，各17只。兩組均給予基礎顆粒飼料喂養，每天150g。姜黃素組每天給予姜黃素200mg/kg灌胃;對照組和模型組每天給予生理鹽水灌胃。每周稱重1次，根據體質量調整給藥量，持續治療4周。實驗周期共12周。

2.2 標本采集 實驗結束時頸動脈放血處死動物，采血分離血清，部分肝組織于液氮中速凍后保存于-80℃冰箱用于常規病理檢查及免疫組化測定。

2.3 肝組織病理學觀察 常規石蠟包埋，5μm厚連續切片，分別進行蘇木素-伊紅（HE）染色、Van Gies?son（V-G）苦味酸酸性復紅染色，光鏡下觀察肝小葉內炎細胞浸潤、纖維增生及纖維間隔等病理變化。炎癥活動度半定量計分系統包括匯管區炎癥（P）、小葉內炎癥（L）、碎屑壞死（PN）、橋接壞死（BN）4項，每項根據病變程度分別計0～4分，計分公式為P+L+ 2（PN+BN）。肝纖維化采用半定量計分系統[6]，包括小葉靜脈周/竇周（L）、匯管區（P）、纖維間隔數量（N）、纖維間隔寬度（W）4項，每項根據病變程度分別計0～4分，計分公式為L+P+2（N×W）。

2.4 肝組織免疫組化測定 免疫組織化學采用SP法，操作步驟參照說明書，用已知陽性片作為陽性對照，用PBS緩沖液液取代一抗作為陰性對照。TNF-α蛋白的陽性表達主要以細胞質呈棕黃色或棕褐色者為準，選擇具有代表性的多個高倍視野（× 400），采用IPP軟件計算平均光密度值（Mean Densi?ty）。

3 實驗結果

3.1 肝組織炎癥活動度和纖維化程度 與正常對照組比較，模型組家兔肝組織匯管區可見較多炎性細胞浸潤，肝細胞呈點狀、灶狀及碎屑樣壞死，偶見小葉中央靜脈、匯管區橋接壞死；姜黃素組治療后，肝組織炎癥活動計分和纖維化計分顯著低于治療前和模型組（P均＜0.05）；V-G染色顯示，與正常對照組比較，模型組肝組織可見中央靜脈周圍、竇周及匯管區內纖維組織增生明顯,匯管區擴大,偶見增生的纖維組織匯管區向小葉內延伸,不完全分割肝小葉；姜黃素組治療后肝組織纖維化程度明顯減輕（P＜0.05），見表1。

表1 各組家兔肝組織炎癥活動度、纖維化計分比較（±s）

表1 各組家兔肝組織炎癥活動度、纖維化計分比較（±s）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05；與治療前比較，*P＜0.05

組 別n/只 炎癥活動度計分 纖維化計分正常對照組姜黃素組模型組10 17 治療前治療后17 治療前治療后1.25±0.27 16.69±6.12△△6.67±1.46*▲15.35±6.13△△10.23±4.56* 1.53±0.51 11.56±3.29△△3.68±1.90*▲12.32±3.12△△8.34±2.57*

3.2 各組家兔肝組織TNF-α表達水平 正常對照組TNF-α無明顯表達，NAFLD模型組TNF-α表達明顯增強（P＜0.05），姜黃素組TNF-α蛋白表達顯著低于NAFLD模型組（P＜0.05），見表2。

表2 各組家兔肝組織TNF-α表達水平比較（±s）

表2 各組家兔肝組織TNF-α表達水平比較（±s）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05

組別n/只 治療前 治療后10 17 17正常對照組姜黃素組模型組0.05±0.05 0.52±0.08△0.54±0.10△0.07±0.04 0.18±0.07▲0.40±0.09

3.3 姜黃素組TNF-α表達與炎癥活動度、纖維化的關系 姜黃素組家兔肝組織TNF-α表達水平與肝組織炎癥活動度、纖維化呈顯著正相關（r=0.52，r=0.61，P＜0.05），見圖1。

圖1 姜黃素組TNF-α表達與炎癥活動度、纖維化相關分析

4 討論

腫瘤壞死因子α（TNF-α）源于單核-巨噬細胞，是參與慢性肝臟損傷重要的細胞因子之一。TNF-α的表達及血脂水平的升高與機體脂肪含量平行[7]。TNF-α可導致肝細胞壞死和凋亡[8]，且在肝纖維化形成過程中，對HSC的增殖、活化、合成細胞外基質以及金屬蛋白酶及其組織抑制劑的釋放均有重要作用。增加的TNF-α與肝細胞膜上的TNF-αⅠ受體結合，進入肝細胞內，與線粒體等細胞器結合，激活某些蛋白酶并使磷脂酶A活性升高，自由基生成增加，引起肝細胞膜結構破壞，促進肝細胞壞死及凋亡，趨化中性粒細胞，激活肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC），使HSC轉化為肌成纖維細胞，刺激肌成纖維細胞合成細胞外基質，導致肝纖維化；也可增強HSC的趨化性，促進其增殖，通過肝細胞的炎癥反應和壞死，間接促進肝組織的纖維化[9]。

本實驗結果顯示，高脂飲食所致的家兔NAFLD模型肝臟炎癥活動度、纖維化程度和TNF-α蛋白水平明顯升高；TNF-α蛋白與炎癥活動度、纖維化呈正相關。姜黃素治療后TNF-α蛋白含量相應降低，肝臟脂肪變性逆轉，肝炎癥活動度和纖維化程度明顯減輕，顯示姜黃素具有治療NAFLD、預防和改善脂肪肝和肝纖維化的作用。其作用機制可能與姜黃素減少TNF-α的表達，抑制蛋白酶并使磷脂酶A活性降低，減少cyclinD1等細胞周期激活蛋白表達，增加P21等細胞周期抑制蛋白表達，從而減輕肝細胞壞死和肝組織炎癥，減少細胞因子相關性損害，抑制HSC的增殖和誘導HSC凋亡，達到預防NAFLD纖維化發生的作用。據報道[10]，家兔NAFLD模型PPARγ蛋白表達明顯減弱，姜黃素治療后PPARγ蛋白表達明顯增強。國內王戰建等[11]研究顯示，上調的PPARγ對TNF-α具有抑制作用。提示PPARγ與TNF-α的表達可能存在負相關，姜黃素可能通過上調PPARγ的表達抑制TNF-α，從而減輕脂肪變性、肝炎癥活動度和纖維化程度。

［1］Ayata G，Gordon FD，LewisWD，etal.Cryp togenic cirrhosis: clinic pathologic findings at and after liver transp lantation［J］.Hum Pathol，2002，33（11）:1098-1104.

［2］Sanyal AJ.Mechanisms of Disease:pathogenesis of nonalco?holic fatty liver disease［J］.Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol，2005，2（1）:46-53.

［3］Ong JP，Younossi ZM.App roach to the diagnosis and treat?ment of nonalcoholic fatty liver disease［J］.Clin LiverDis，2005，9（4）:617-634.

［4］Sanyal AJ.AGA technical review on nonalcoholic fatty liver disease［J］.Gastroenterology，2002，123（5）:1705-1725.

［5］王春彬，高大中.姜黃素的研究進展以及在心血管疾病中的應用［J］.心血管病學進展，2005，26（6）:614-616.

［6］中華肝臟病學會肝纖維化學組.肝纖維化診斷及療效評估共識［J］.中華肝臟病雜志，2002，10（5）:327-328.

［7］Adinolfi LE，Utili R，Andreana A，et al.Serum HCV RNA levels correlate with histological liver damage and concur with steatosis in progression of chronic hepatitis C［J］.Dig DisSci，2001，46（8）:1677-1683.

［8］Wigg AJ，Roberts-Thomson IC，Dymock RB，et al.The role of small intestinalbacterialovergrowth，intestinal permeabil?ity，endotoxaemia，and tumour necrosis factor alpha in the pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis［J］.Gut，2001，48（2）:206-211.

［9］陳煒，陳雄雄，金涌，等.川芎嗪對實驗性肝纖維化大鼠TNF-α、IL-4和IFN-γ表達的影響［J］.世界臨床藥物，2010，31（3）:153-156．

［10］周玲玲，林瓊瓊，周伶俐，等.姜黃素對非酒精性脂肪肝家兔血脂及肝組織PPAR-γ水平的影響［J］.浙江中西醫結合雜志，2012，22（1）:7-10.

［11］王戰建，張耀，蘇杰英，等.羅格列酮對高糖高脂飲食誘導糖尿病大鼠脂肪肝的治療作用［J］.中國糖尿病雜志，2008，16（9）:529-532.

TheEf fectsofCurcuminontheExpressionofTumorNecrosisFactor-alphainNon alcoholicFattyLiv?erDiseaseRabbits

ZHAOZh i guang，ZHOULi ng l i ng，LINQi ongq i ong，e t a l.Depa r tmen t o f Pa t ho l ogy,t he Se c?ond Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou(325000),China

Objective:To investigate the effects of curcumin on the pathological alterations and tumor necrosis factor-alpha(TNF-α)of liver tissue in non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)rabbits.M ethods:Thirty-four rab?bits model of NAFLD were randomly divided into 2 groups:control group(17 animals)and treatment group(17 an?imals).Both groups were fed standard diet.The treatment group

oral curcumin at dose of 200mg·kg-1·d-1and the control group received equivalent oral curcumin-free sodium chloride solution once daily for 1 month. The expression of TNF-αprotein was measured by immunohistochemistry and the pathological alterations in the liver were examined.Results:Curcumin significantly decreased the expression of TNF-αprotein(P＜0.05)and alle?viated the severity of inflammation and fibrosis in the liver sections.The expression of TNF-αprotein was posi?tively correlated with scores of inflammation and fibrosis.Conclusion:Curcumin can improve the hepatic inflam?mation and hepatic fibrosis of NAFLD rabbits.

non-alcoholic fatty liver disease TNF-α hepatic fibrosis curcumin

2012-11-26