蘭索拉唑抑制幽門螺桿菌誘導胃上皮細胞表達COX-2

魯君艷 張艷 伍海英 李翔 劉勝

幽門螺桿菌(helicobacter pylori，Hp)是外形呈螺旋狀的一種微需氧革蘭陰性桿菌。是引起慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤的重要病因[1－2]。環氧化酶(cyclooxygenase，COX)是催化花生四烯酸形成前列腺素的關鍵酶。其中，COX-2在生理狀態時機體細胞很少表達或表達缺如。當細胞受到諸如炎癥、損傷、激素、生長因子、細胞因子、炎癥因子、腫瘤誘導劑及紫外線照射等理化因素刺激時，COX-2 迅速合成，表達增加。其產物PGE2作為一種較強的細胞免疫抑制劑，能抑制免疫系統的監管作用，有利于癌細胞的免疫逃逸。同時，PGE2本身還具有抑制胃腸道上皮細胞凋亡和促進其增生的作用。并參與了腫瘤發生、發展的病理生理過程。因此，適當抑制該酶的表達對于治療Hp相關性胃部疾病應該是有益的[3－4]。蘭索拉唑（lansoprazole，LPZ）是由日本武田公司開發的新一代質子泵抑制劑，近年研究顯示，LPZ除了具有抗酸作用外，還有一定的抗炎效應[5]。如上調血紅素氧合酶1的表達，抑制NF-κB的激活，最終抑制Hp誘導的IL-8產生以及中性粒細胞遷移從而降低炎癥反應程度[6]。此外，LPZ也能有效降低吲哚美辛誘導的腸炎[7]。因此，本研究擬采用胃上皮細胞系AGS為研究對象，采用Hp感染后，觀察LPZ對COX-2 表達及PGE2產生的影響。

1 資料與方法

1.1 主要實驗試劑 COX-2鼠抗人多克隆抗體為Santa Cruz產品, 抗人HRP標記兔抗鼠多克隆抗體購自武漢博士德生物技術有限公司。蘭索拉唑購自日本武田藥品有限公司（Takeda Pharmaceuticals）。青霉素、鏈霉素、二甲基亞砜（DMSO）購自華美生物公司。Hp為本研究所保存（ATCC編號：700392）；胃上皮細胞系AGS購自ATCC（編號：CRL-1739）。

1.2 HP的培養及菌液制備 取含Vancomycin(10mg/L)、Amphotericin B(10 mg/L)、Polymyxin B(2500U/L)、TMP(5 mg/L)和 7%脫纖維羊血的哥倫比亞血瓊脂平板分區劃線，微需氧環境（10% CO2，5% O2，85% N2）37℃，培養 48h。取單菌落進行生化反應、革蘭染色和PCR擴增鑒定，確定為陽性后，用滅菌的生理鹽水將Hp從血瓊脂平板上洗下，然后調整菌液濃度至1×109CFU/mL。

1.3 AGS細胞培養與感染 AGS細胞用含 10%胎牛血清在RPMI-1640 培養基中于5% CO2，37℃下培養。實驗分為空白對照組（僅給予0.1% DMSO為對照）、Hp感染組（用100 MOI的Hp感染24h）和不同濃度蘭索拉唑組（Hp感染前加入不同濃度蘭索拉唑作用3h）。Hp感染結束后，獲取細胞用于以下研究

1.4 實時定量PCR檢測AGS細胞中COX-2 的表達 細胞處理結束后，根據試劑盒操作說明提取總RNA（FUJIFILM）并逆轉錄為cDNA，產物用RNA酶處理。設計特異性引物用于檢測COX-2表達的定量。其正向引物：5’-ATCTACCCGCCTCACATCCCT-3’ ；反向引物：5’-AGCTGCTCATCATCCCATTCT-3’ 。利用Light-Cycler PCR儀對COX-2 進行擴增：95℃ 10s；60℃ 40s，共35個循環。同時采用β-actin為內參。數據以COX-2/β-actin比值表示。

1.5 Western blot檢測AGS細胞中COX-2 表達 6孔板中細胞經PBS漂洗后，加入細胞裂解液裂解30min，4℃ 12000g離心15min，上清即為細胞總蛋白。裂解液中的蛋白用Bradford試劑在分光光度計中測定OD 595處吸光度。50～70μg總蛋白在5%～10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，并轉移至PVDF膜上，經5%無脂牛奶封閉后，分別用孵育一抗，二抗，ECL發光，顯影。

1.6 PGE2檢測 收集感染后24孔板中細胞上清液，按照ELASA 試劑盒說明書檢測PGE2水平。即100μL細胞上清液加入到每個捕獲抗體包被的微孔板中，室溫孵育2h。洗板后，加入

100μL檢測抗體，室溫繼續孵育2h。隨后棄混合物，每孔加入

100μL streptavidin-HRP，室溫避光孵育20min。最后，每孔加入100μL底物，室溫避光孵育20min，然后加入50μL終止液，分光光度計檢測450nm處OD值。

1.7 統計學方法 實驗數據采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，組間比較采用t檢驗，計量資料以均數±標準差（±s）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蘭索拉唑對Hp感染AGS細胞后COX-2 mRNA表達的影響 實時定量PCR結果顯示，Hp未感染前AGS細胞COX-2 表達很低。Hp感染后其mRNA水平顯著增高。而AGS細胞預先經30～100μmol/L LPZ處理后，COX-2 mRNA水平有所降低，見圖1。

圖1 蘭索拉唑對Hp感染AGS細胞后COX-2 mRNA表達的影響

2.2 蘭索拉唑對Hp感染AGS細胞后COX-2 蛋白表達的影響 Western blot顯示，AGS細胞中COX-2 表達很低。Hp感染能使其表達水平增加，而不同濃度LPZ處理后能抑制該效應，見圖2。

圖2 LPZ對Hp誘導AGS細胞表達COX-2 蛋白的影響

2.3 蘭索拉唑對Hp誘導AGS細胞產生PGE2的影響 基礎狀態下AGS細胞幾乎不產生PGE2。100 MOI Hp感染后，PGE2含量達（76±6.5）pg/μg protein。而AGS細胞若用 100μmol/L LPZ預孵育 2h，可顯著降低PGE2含量，見圖3。

圖3 蘭索拉唑對Hp誘導AGS細胞產生PGE 2的影響

3 討論

雖然機體對于Hp感染能夠誘導產生較強的細胞與體液免疫應答，但對清除Hp感染依然有限，因此，一旦感染Hp，將長時間維持在持續感染狀態。Hp感染引起的炎癥反應是Hp的重要致病因素之一。有研究顯示，有效控制Hp感染引起的炎癥反應能在一定程度上降低消化系統相關疾病的發生。在炎癥與癌癥的發生過程中，COX-2 在其中起重要作用，COX-2 蛋白的過量表達是胃炎和粘膜損傷的重要機制，也是胃腫瘤發生的早期診斷標志。除了COX-2，PG也與各種胃腸道疾病密切相關。COX-2 在炎癥部位被快速誘導表達，產生大量的炎癥性PG和其它炎癥介導物如細胞因子和蛋白酶類，引起炎癥反應。COX-2產生的大量炎癥性PG可引起胃黏膜的損傷。PGE2作為一種較強的細胞免疫抑制劑，本身還具有抑制胃腸道上皮細胞凋亡和促進其增生的作用。PGE2刺激bcl-2蛋白表達，bcl-2可抑制細胞凋亡，使細胞增殖和凋亡失衡，從而促進腫瘤發生。由于COX-2 和PG是預防癌癥和各種炎性相關疾病的的重要靶點，因此，抑制其過度表達除了能減輕局部炎癥反應外，對腫瘤的防治也具有重要的意義[8]。

LPZ是一種第二代質子泵抑制劑。對由組胺、胃泌素和氨甲酰甲基膽堿刺激引起的胃酸分泌均有強力抑制作用，并具有顯著的胃蛋白酶分泌抑制作用。此外，LPZ抗菌活性與檸檬酸鉍相似，而抗菌力為奧美拉唑的4倍。近年的研究證實，LPZ能抑制小鼠巨噬細胞分泌IL-8、IL-1 β和TNF-α，同時也能抑制ERK 1/2信號通路的活性[9－10]。這表明LPZ除了其固有的抗酸活性外，對機體的免疫系統也可能具有一定的調節作用。迄今為止，有關質子泵抑制劑對Hp感染后胃上皮細胞炎癥反應方面的實驗還很少，目前尚很難確定其在炎癥反應中的作用地位。

本研究證明，LPZ能在蛋白和mRNA水平抑制Hp感染后胃上皮細胞表達COX-2 并產生PG。由于Hp感染誘導的COX-2 的過度表達是胃癌和各種炎性疾病發生的重要因素，因此，LPZ對治療帶來的臨床益處可能遠超出其抗酸作用所產生的效果，它在抗酸分泌的同時能有效改善Hp感染后的炎癥反應，最終發揮胃黏膜保護作用。因此，我們可通過該效應抑制COX-2表達或減低此酶的活性來抑制大量PG的產生，從而治療Hp相關性胃黏膜疾病。

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