OK-432腫瘤疫苗對DBA/2小鼠脾臟細胞中Th1細胞因子以及TNF-α分泌的影響

鄭曉東 趙 棟 武 峰 溫 璟 羅曉晉* 李憲起（山西醫科大學口腔系，山西 太原 030001）

OK-432腫瘤疫苗對DBA/2小鼠脾臟細胞中Th1細胞因子以及TNF-α分泌的影響

鄭曉東 趙 棟 武 峰 溫 璟 羅曉晉* 李憲起（山西醫科大學口腔系，山西 太原 030001）

目的利用DBA/2小鼠移植舌癌荷瘤模型，探討OK-432腫瘤疫苗對DBA/2小鼠脾臟細胞中Th1細胞因子以及TNF-α分泌的影響。方法ELISA定量檢測脾臟淋巴細胞所產生的IFN-γ，IL-2，TNF-α等細胞因子的分泌水平。結果OK-432腫瘤疫苗組中IFN-γ、IL-2以及TNF-α的含量明顯高于實驗對照組（P＜0.05）。結論OK-432腫瘤疫苗可刺激荷瘤小鼠脾臟細胞Th1細胞及TNF-α的分泌，增強DBA/2小鼠的抗腫瘤免疫功能。

OK-432腫瘤疫苗；ELISA；IFN-γ；IL-2；TNF-α；DBA/2小鼠

腫瘤疫苗，在現代腫瘤的治療中以其作為腫瘤術后、化療、放療的一種重要的輔助治療手段（Biotherapy）已經越來越受到了人們的關注。如多肽疫苗[1]、基因疫苗[2]、重組病毒疫苗[3]、腫瘤細胞疫苗[4-6]、樹突細胞疫苗[7]等，通過了腫瘤抗原以及相應的免疫調節分子蛋白的表達，改善腫瘤組織局部免疫微環境，增強T細胞的抗腫瘤免疫效應。OK-432（picibanil）作為一種細菌類且具有非特異性免疫功能的免疫賦活劑，是經由青霉素處理后的溶血性鏈球菌A組Ⅲ型低毒性變異株Su研制而來的。研究證明了OK-432作為一種免疫反應調節劑，它不僅可以誘導活化CD3+，CD4

+，LeU8-，CD45RO+的細胞表面HLA-DR，CD25，ICAM-1的表達[7]，同時還能促進T細胞分泌IFN-γ，TNF-α，IL-6[8]等細胞因子，尤其是經Triton X-114提純后的OK-432，無論是即可效應還是遠期效果都能有效的促進局部抗癌免疫反應的進行，同時還可以更加顯著的提高細胞毒性T細胞毒腫瘤細胞的殺傷效應[9]。研究表明，OK-432腫瘤疫苗[10]可以顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，并延長其生存期，但其激發和增強宿主的特異性抗腫瘤免疫效應機制尚不十分清楚。本研究著重探討OK-432腫瘤疫苗對小鼠脾臟Th1細胞因子以及TNF-α分泌的影響，旨在對OK-432腫瘤疫苗的免疫賦活作用，特別是其對機體Th1細胞的影響提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

6周齡的DBA/2雌鼠購自北京維通利華公司，實驗開始前在觀察室喂養一周以觀察其狀態，飼養室由山西醫科大學動物培養中心提供；KLN-205鱗癌細胞由上海腫瘤細胞庫提供；OK-432注射用粉劑由中外制藥株式會社（日本）提供，其計量為5KE（Klinische Einheit），1KE等量0.1mg的凍干鏈球菌，使用時需要PBS溶解。RPMI-1640培養基購自Gibco公司；青鏈霉素購自Solarbio公司；胰蛋白酶（含EDTA），無菌PBS，D-Hanks緩沖液，紅細胞裂解液以及ELISA試劑盒均為BOTER公司出品；無支原體胎牛血清為浙江天杭生物科技有限公司出品。

1.2 模型建立及動物處理方法

①腫瘤細胞培養：KLN-205腫瘤細胞在37℃，5%CO2恒溫箱傳代培養，每次使用的培養液按照45mL的RPMI-1640培養液加入5mL胎牛血清，0.5mL的雙抗的比例配制。選取培養4代以上活力旺盛的腫瘤細胞作為靶細胞。②脾臟淋巴細胞培養：將48只DBA/2小鼠隨機分為OK-432組，PBS對照組，OK-432腫瘤疫苗組，每組16只。分別于小鼠右側腹腔注射以下試劑，OK-432組注射0.7KE/100μl；PBS對照組注射PBS液100μL；OK-432腫瘤疫苗組注射OK-432疫苗5× 105/100μL，每周一次，連續注射3周。分別在3次注射試劑結束后于第1天，第3天，第5天，第7天取出脾臟。將取出的脾臟置于Hanks液中，按所分組分別剔除筋膜組織以及周圍脂肪組織，用眼科手術剪剪碎，用玻璃研磨器進行研磨，用Hanks液沖洗后用200目濾網過濾。將濾液收集至15mL離心管中，2000r/min離心3min棄上清。加入紅細胞裂解液，混勻脾細胞，靜置3～4min，待紅細胞完全破碎后，2000r/m離心3min，棄上清去除紅細胞，Hanks液沖洗，1500r/m離心3min，棄上清，用RPMI-1640培養液重懸細胞，計數板計數，調節細胞濃度為5 ×106/mL，臺盼蘭染色檢測脾細胞存活率＞95%；接種至培養板中，標記好分組，CO2恒溫培養箱中培育72h。用計數板計數培育72h的脾臟細胞，調整其濃度為2×106/2mL。加入培養四代以上的KLN-205腫瘤細胞作為靶細胞。效靶比例為50∶1、100∶1。在CO2恒溫箱中共同培育24h。將培育好的細胞混合液收集至離心管中，1500r/m，3min離心，取上清液。

1.3 細胞因子測定

采用夾心ELISA法測定IFN-γ，IL-2，TNF-α在培養液中的含量。每次測定值為三個復孔的平均值。運用ELISACalc軟件進行Hill曲線擬合，生成曲線方程，根據所得OD值得出培養液中各因子的含量。

1.4 統計分析

應用SPSS16.0軟件采用重復測量方差分析對所得數據進行統計學分析。

2 結 果

在腫瘤細胞的刺激下，體外培養72h后的脾淋巴細胞OK-432組及OK-432疫苗組均可以誘導產生細胞因子IFN-γ，IL-2，TNF-α。如圖1所示，在疫苗組中IFN-γ與TNF-α的含量要高于IL-2在培養液中的濃度，其中TNF-α的濃度最高。圖2顯示，IFN-γ在三組中總體呈上升趨勢，且在不同的實驗組中含量明顯不同。在不同時期脾淋巴細胞培養液中，細胞因子IL-2以及INF-γ的濃度也是有所變化的，第一天的細胞因子含量要略低于其后幾天的細胞因子含量，在第7天時達到最大值。另外TNF-α的變化較為有特點，在第1天后顯著提升，在第3～5天階段較為平穩，在第7天時出現回落。同時，如圖3所示，當我們將靶細胞濃度提升1倍時，效應細胞的免疫作用也相應的提高，經檢測后發現細胞因子的濃度也相應提升1倍左右。

3 討 論

OK-432作為一種細菌類非特異性免疫賦活劑，已經廣泛的應用于腫瘤的研究與治療，除了誘導活化CD3+，CD4

+等免疫細胞表面HLA-DR，LFA-1和ICAM-1的表達，促進CD4+，T細胞分泌IFN-γ，TNF-α，IL-6等細胞因子以外，經OK-432誘導培養后的樹突狀細胞[11]（OK-DC）還可以表現出特異性的抗腫瘤細胞毒性[12]。本試驗表明，OK-432組以及OK-432腫瘤疫苗組中小鼠的脾臟淋巴細胞在經KLN-205腫瘤細胞刺激后，可以產生IL-2、TNF-α、INF-γ。在相同的培養條件下，以及一定的生長環境中，在不同濃度的靶細胞刺激下，各個細胞因子呈現出一定的增高趨勢。其中，IL-2在所提取的培養液中的濃度比較低，出現這一現象可能是由于OK-432刺激了機體中IL-2受體的表達，所以導致了在培養液中IL-2的消耗增加[13]。INF-γ以及TNF-α在培養液中濃度較大，Th1細胞受到靶細胞刺激后，使得其INF-γ分泌增加，同時巨噬細胞也大量的分泌TNF-α，使得其濃度隨著靶細胞的增量而成正相關。我們還發現，在注射后第一天收集的淋巴細胞經72h培養后對靶細胞的刺激敏感性不是最強，而在第三天到第五天收集的脾臟淋巴細胞的應答反應呈上升趨勢，同時TNF-α在第7天時出現下滑趨勢，出現這種結果可能是在早期條件培養液中的脾臟淋巴細胞受到刺激后，增強了其細胞免疫功能，因子濃度有升高的趨勢，隨著時間的推移，淋巴細胞負荷的增加，脾淋巴細胞中的抑制性因素增大，使得條件培養液中的細胞因子消耗階段性增大所導致的TNF-α濃度表現為階段性下滑的趨勢。

綜上所述，在DBA/2小鼠移植舌癌荷瘤模型中，OK-432腫瘤疫苗可誘導宿主Th1細胞主導的細胞免疫活化，誘發有效的CTL應答，激發和增強宿主對腫瘤的特異性免疫功能。

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圖1 疫苗組中不同細胞因子的變化趨勢

圖2 IFN-γ在不同實驗組中的變化趨勢

圖3 疫苗組中TNF-α在不同濃度靶細胞刺激下的變化趨勢

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The Effect of OK-432 Tumor Vaccine for DBA/2 Mice Spleen Cells of Th1 Cytokines and TNF-α Secretion

ZHENG Xiao-dong, ZHAO Dong, WU Feng, WEN Jing, LUO Xiao-jin*, LI Xian-qi

(Department of Stomatology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

ObjectiveTo research the Th1 cytokines and TNF-α secretion of the DBA/2 mice spleen cells with Ok-432 tumor vaccine in DBA/2 mice transplanted the tongue cancer tumor models.MethodsELISA detection the IFN-gamma, IL-2 and TNF-α secretion levels of spleen lymphocytes.ResultThe IFN-γ, IL-2 and TNF-α content of OK-432 tumor vaccine group is significantly higher than the experimental control group (P＜0.05).ConclusionOK-432 tumor vaccine can stimulate the Th1 cytokines and TNF-α secretion of tumor-bearing mouse spleen cells, enhance the anti-tumor immune function of the DBA/2 mice.

OK-432 tumor vaccine; ELISA; IFN-γ; IL-2; TNF-α; DBA/2 mice

R392.9

B

1671-8194（2013）18-0011-03

*通訊作者：E-mail：xiaojinluo1958@163.com