中國人群2型糖尿病相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)分析及基因型交互作用研究

焦紅肖 ，蔡春友 ，魏鳳江 ，時(shí)文濤 ，陳莉明 ，林靜娜 ，韓鴻玲 ，凌 超 ，于 萍 ，呂 佳 ，楊付花 ，李明珊 ，馮淑芝，李衛(wèi)東

（1.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，天津300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院，天津300070；3.天津市人民醫(yī)院，天津300121；4.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津300052）

2型糖尿病是由包括遺傳因素及環(huán)境因素在內(nèi)的多種因素共同作用導(dǎo)致的復(fù)雜性狀疾病之一，由慢性血糖水平升高所導(dǎo)致，并以胰島素分泌受損和（或）胰島素抵抗為臨床特點(diǎn)[1-2]。目前，全球成年人的糖尿病患病率達(dá)到6.4%，約2.85億，預(yù)計(jì)到2030年將增加至7.7%，約4.39億[3]。因此，關(guān)于2型糖尿病的研究已成為近年來的熱點(diǎn)之一。隨著全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome wide association studies，GWAS）在遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用，越來越多的2型糖尿病易感基因被發(fā)現(xiàn)，迄今為止已發(fā)現(xiàn)了40多個(gè)[4]，然而，這僅解釋了疾病遺傳機(jī)制的一小部分原因，基因型交互作用的研究將進(jìn)一步地解釋疾病遺傳的部分原因，增加疾病的遺傳風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)度。由于復(fù)雜性狀疾病不僅受到遺傳因素的影響，還有環(huán)境因素的作用，因此不同的種族背景、地域環(huán)境等都可能造成不同的研究結(jié)果。本研究主要選取一些糖尿病候選基因，通過病例-對(duì)照研究，一方面檢測(cè)已知的易感基因在不同人群中與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)性，另一方面通過關(guān)聯(lián)分析以及交互作用分析以期發(fā)現(xiàn)新的易感基因位點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究從天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院、天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院、天津市人民醫(yī)院、天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院4家醫(yī)院隨機(jī)收集了1463名無血緣關(guān)系的中國天津地區(qū)人群為研究對(duì)象，其中病例組為2型糖尿病患者915名（男性500名，女性415名），平均年齡為（58.36±12.27）歲，以 2010年美國糖尿病協(xié)會(huì)公布的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)為參照標(biāo)準(zhǔn)確定[空腹血糖（FPG）≥7.0mmol/L，及/或口服糖耐量試驗(yàn)（OGTT）2 h血糖（P2hG）≥11.1 mmol/L]；對(duì)照組為非糖尿病患者548名（女性84名，男性464名），年齡≥70歲，血糖正常（FPG<6.1 mmol/L）。調(diào)查和取樣均征得受試者本人同意并簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 根據(jù)高鹽法，應(yīng)用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，Nanodrop（微量紫外分光光度計(jì)）測(cè)定其濃度和純度以確保達(dá)到使用要求，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 候選基因的選取 根據(jù)以往國內(nèi)外報(bào)道及本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，選取17個(gè)與2型糖尿病相關(guān)的基因作為候選基因 [選取的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)見表 1]。

表1 選取的候選基因SNP位點(diǎn)Tab 1 SNPs selection for type 2 diabetes candidate genes

1.2.3 基因分型 1463例樣本的基因分型由基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-T-OF MS）（華大基因）技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行，每批次的基因分型結(jié)果均錄入Filemaker Pro數(shù)據(jù)庫進(jìn)行整理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 在統(tǒng)計(jì)分析之前應(yīng)用SPSS17.0軟件先對(duì)樣本表型資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，運(yùn)用PLINK[5]軟件對(duì)二分變量（糖尿病與非糖尿病）進(jìn)行病例-對(duì)照的關(guān)聯(lián)分析與基因型交互作用的研究。

2 結(jié)果

2.1 基因交互作用 通過PLINK軟件對(duì)21個(gè)位點(diǎn)之間進(jìn)行了兩兩配對(duì)的基因型交互作用分析，得出6對(duì)SNP×SNP之間存在較為顯著的交互作用（P<0.05），即 ABI2 與 MYH9、LPHN3 與 LIMK2、ABCG2 與 TOX、NUB1 與 CDKN2A/B、TBX5 與SMAD3、LIMK2與 SFI1（表 2）。其中 CDKN2A/B、ABCG2、LPHN3不僅在關(guān)聯(lián)分析中得出與2型糖尿病存在顯著的關(guān)聯(lián)性，而且在基因型交互作用中也與2型糖尿病存在一定的相關(guān)性。另外，基因型交互作用的研究檢測(cè)出一些單個(gè)SNP位點(diǎn)所檢測(cè)不到的微效基因，例如：ABI2、MYH9、TOX、TBX5、SMAD3等。

表2 2型糖尿病病例-對(duì)照的基因型交互作用結(jié)果Tab 2 Genotype interactions(epistasis)associated with type 2 diabetes in cases and controls

2.2 關(guān)聯(lián)分析 通過對(duì)樣本17個(gè)基因21個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行病例-對(duì)照的關(guān)聯(lián)分析得出5個(gè)基因的5個(gè)SNP位點(diǎn)與2型糖尿病之間的關(guān)聯(lián)性達(dá)到顯著水平（P<0.05），分別為 CDKN2A/B（rs10811661，P=2.910×10-5）、IGF2BP2（rs4402960，P=0.0006）、CDKAL1（rs7756992，P=0.0028）、LPHN3（rs6856526，P=0.0031）、ABCG2（rs2231142，P=0.0315）（表 3）。其中 CDKN2A/B、IGF2BP2、CDKAL1 這 3 個(gè)基因是筆者對(duì)先前研究結(jié)果的一個(gè)驗(yàn)證，LPHN3、ABCG2與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)性是一個(gè)較新的發(fā)現(xiàn)。分析過程中剔除了一些基因分型過程中未被檢測(cè)到的位點(diǎn)，使得各個(gè)位點(diǎn)的病例、對(duì)照數(shù)不一定相同。

表3 2型糖尿病病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)分析中有顯著關(guān)聯(lián)的SNPsTab 3 SNPs significantly associated with type 2 diabetes in cases and controls

3 討論

通過本次研究我們檢出了5個(gè)基因與2型糖尿 病 相 關(guān) ， 即 CDKN2A/B、IGF2BP2、ABCG2、LPHN3、和CDKAL1。隨著“人類基因組計(jì)劃（human genome project，HGP）”和“人類基因組單體型圖計(jì)劃（the international haplotypemap project，HapMap）”的相繼完成，高通量基因分型技術(shù)的飛速發(fā)展，GWAS已成為目前遺傳學(xué)最為流行的研究手段。近年來，大量關(guān)于2型糖尿病的GWAS研究使得相當(dāng)一部分易感基因被逐漸發(fā)現(xiàn)，CDKN2A/B、IGF2BP2、CDKAL1也在大量的GWAS研究中得出與2型糖尿病相關(guān)，并在不同人群中得到驗(yàn)證[6-8]。我們的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論，而Tsai等[9]在中國漢族人群的GWAS研究中并沒有得出CDKAL1、IGF2BP2與2型糖尿病之間存在相關(guān)性，這可能是由于遺傳異質(zhì)性、表型復(fù)雜性、種族差異以及地域差異等原因造成的。

關(guān)于 CDKN2A/B、CDKAL1、IGF2BP2 與 2 型糖尿病的研究不僅僅是遺傳學(xué)上的，生物學(xué)上研究得出 CDKN2A/B[10-12]、CDKAL1[11-12]參與細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶通路，并可能因此影響β細(xì)胞的再生而使胰島素分泌減少造成血糖水平升高，IGF2BP2編碼IGF2的mRNA結(jié)合蛋白并在蛋白合成過程中指導(dǎo)mRNA到特定的亞細(xì)胞位置上，與胰腺的發(fā)展相關(guān)[12]，可能會(huì)增加胰島素抵抗[13]，增加2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

LPHN3在人體內(nèi)編碼G蛋白偶聯(lián)受體的蛛毒素受體亞科，蛛毒素受體參與細(xì)胞粘附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。ABCG2編碼ATP結(jié)合盒亞家族G成員2，在胎盤期已顯著表達(dá)。有研究表明ABCG2在肝臟和腎臟表達(dá)，可能與尿酸等的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[14]。在本次的病例-對(duì)照研究中，通過關(guān)聯(lián)分析我們得出LPHN3和ABCG2與2型糖尿病之間的關(guān)聯(lián)已達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著水平，并在基因型交互作用研究中也得出LPHN3、ABCG2均與其他基因存在交互作用，從而可以推出這兩個(gè)基因可能與2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。Zemunik等[15]通過GWAS研究得出LPHN3與HDL之間存在顯著關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)室在關(guān)于2型糖尿病的數(shù)量性狀研究中已得出MYH9和ABI2基因的多態(tài)性與血糖、血壓和胰島素抵抗相關(guān)表型存在關(guān)聯(lián)，并且在以胰島素敏感性指標(biāo)為表型的交互作用的研究中得出ABCG2與ABI2之間存在顯著的交互作用[16]。上述實(shí)驗(yàn)僅是病例組的數(shù)量性狀研究，目的在于研究候選基因與2型糖尿病各表型之間的關(guān)系；而本次的研究是在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，擴(kuò)大樣本量，設(shè)置正常對(duì)照組，進(jìn)行關(guān)于2型糖尿病二分變量（患病和非患病）的病例-對(duì)照研究，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)、研究對(duì)象和關(guān)聯(lián)分析的方法上均有很大不同。在本研究中，我們得到的是對(duì)2型糖尿病患病狀態(tài)本身的關(guān)聯(lián)。

單純的候選基因的關(guān)聯(lián)分析或GWAS不能檢測(cè)位點(diǎn)間的交互作用對(duì)性狀的影響[17]，而現(xiàn)有的2型糖尿病基因不能解釋該疾病的較高遺傳度。Manolio等[18]認(rèn)為基因交互作用、微效基因和拷貝數(shù)變異與這些“丟失的遺傳度”有關(guān)。然而，由于本次研究檢測(cè)的位點(diǎn)數(shù)尚少，因而基因型交互作用的結(jié)果不是太顯著，本研究檢測(cè)了一些已知的糖尿病相關(guān)位點(diǎn)之間的交互作用，關(guān)于大量位點(diǎn)間的基因型交互作用的研究有待下一步完成。

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