大鼠創傷性腦損傷后創傷區CD34+細胞的聚集與腦水腫預后的關系

王飛飛，金學隆，梁 賓，劉興菊，陳澤群

（天津醫科大學生理學教研室，天津300070）

創傷性腦損傷（traumatic brain injury,TBI）是神經系統常見疾病，其致殘率及致死率高，嚴重影響人類的健康[1]。TBI后腦水腫是造成繼發性腦損傷的主要原因，而損傷后血腦屏障通透性增加不僅能夠加重腦水腫，也使炎性成分易于通過血腦屏障加重腦組織損傷[2]。創傷性腦損傷后，由于組織缺血缺氧CD34+細胞代償性的從骨髓動員到外周血中，并在趨化因子的作用下趨化到損傷區域，分化為內皮細胞，形成新生血管，修復損傷[3]。CD34+細胞在形成新生血管的過程中其與腦水腫預后的關系國內外尚罕見報道。本研究通過大鼠創傷性腦損傷后，損傷腦皮質CD34+細胞數的變化及其與血腦屏障通透性和腦水含量變化的關系，探討CD34+細胞的聚集對腦水腫的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF清潔級成年健康雄性SD大鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司提供）108只，體質量280~320 g，隨機分為假手術組和腦創傷組（TBI組），腦創傷組分為傷后 1、3、5、7、14 d 5 個亞組，每組18只大鼠。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立 選用液壓創傷法制作大鼠腦損傷模型[4]，大鼠采用20%烏拉坦（5 mL/kg）腹腔注射麻醉后，固定于立體定向儀上，頭部備皮消毒，于正中線切開頭皮，分離骨膜，暴露顱骨，在大鼠右側前囟后3 mm，矢狀線旁2 mm處，用磨鉆磨開直徑約為4 mm的圓形骨窗，保持硬腦膜完整。采用玻璃子水門汀固定連接帽于骨窗上,待固定牢固之后,采用液壓腦創傷儀（美國NEWSUN公司MODEL01-B）建立大鼠液壓腦創傷模型，打擊力度為中型：平均為2.14 kPa。打擊后常規消毒縫合。假手術組僅行頭皮切開，打磨骨窗，不進行打擊。

1.2.2 血腦屏障通透性測定 按照Kaya[5]的方法，各組隨機取6只大鼠，經股靜脈注射2%伊文思藍3 mL/kg，1 h后用生理鹽水心臟灌注。取傷側損傷中心區腦皮質（約0.3 g）及對側腦皮質（約0.3 g）分別用電子天平精確稱重，放入盛有5 mL二甲基甲酰胺的試管中，37℃水浴孵育48 h，3000 r/min離心15 min，取上清液，用分光光度計在伊文思藍最大吸收光譜處（λ=632 nm）檢測各待測樣本光密度值（OD值），根據標準曲線計算伊文思藍含量（μg/g）。

1.2.3 腦組織含水量測定 各組隨機取6只大鼠，用20%烏拉坦腹腔注射（5 mL/kg）麻醉，斷頭取腦后將大腦分為左右兩側大腦半球，用濾紙吸除表面的水分及血漬，電子天平分別稱重，計為濕重，然后于100℃烤箱中烘烤48 h至恒重，計為干重（兩次干重之差≤0.001 mg）。腦組織含水量用以下公式計算：腦組織含水量=（濕重－干重）/濕重×100%。

1.2.4 標本制作 各組隨機取6只大鼠，麻醉后依次用生理鹽水和4%多聚甲醛心臟灌注，取腦組織，以損傷灶為中心，取損傷前后冠狀切面3 mm厚腦組織塊置于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h，取出標本，常規脫水、石蠟包埋，作連續冠狀面切片，厚度為6μm，將腦組織貼于預先包被有0.1 mg/mL多聚賴氨酸的清潔玻片上，行HE染色及CD34免疫組化。

1.2.5 免疫組化 參照SABC法，切片經脫蠟、水化后，3%雙氧水抑制內源性過氧化物酶，PBS沖洗，置于95~98℃檸檬酸鈉中煮20 min以修復抗原，待冷卻至室溫后用正常兔血清封閉非特異性抗原，滴加一抗（山羊抗大鼠 CD34，多克隆抗體，1∶1000，R&D Systems，AF4117），4℃冰箱過夜，PBS沖洗，加即用型生物素化的兔抗山羊IgG（武漢博士德）37℃溫箱中孵育30 min，PBS沖洗，滴加試劑SABC（鏈酶親和素-過氧化物酶復合物），37℃溫箱中孵育30 min，PBS沖洗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色。陰性對照采用PBS緩沖液替代一抗，其余所加試劑及步驟相同。每張切片在創傷灶周圍皮質區選取5個不重疊的高倍視野（×40）拍照進行CD34+細胞計數，染成棕黃色的有核的細胞均視為CD34+細胞。

2 結果

2.1 病理學觀察 大鼠中型液壓腦損傷的創傷范圍局限于損傷側大腦皮質，傷側海馬及對側大腦半球均沒有損傷。傷后1、3 d損傷區存在大量的出血點，紅細胞滲出；損傷微血管內皮細胞腫脹，毛細血管腔塌陷呈縫狀，細胞間連接遭到破壞，毛細血管內膜屈曲不平、有斷裂，血管周圍水腫嚴重；損傷區域周圍有炎性細胞浸潤，神經細胞的胞體收縮，胞核深染；傷后7 d損傷區出血點被吸收，有少量紅細胞；炎性細胞呈彌漫性的浸潤，分布于損傷區域；傷后14 d，壞死組織被清除，炎性細胞減少，內皮細胞腫脹程度減輕，有新生小血管的出現。見圖1。

圖1 假手術組和TBI組腦皮質病理圖Fig 1 HE staining of injured cortex in control group and TBI group

2.2 血腦屏障通透性改變 傷側腦皮質伊文思藍含量組間比較有統計學意義（P＜0.01），對側組間比較無統計學意義（P＞0.05）。與假手術組相比，大鼠液壓腦損傷后傷側腦皮質伊文思藍含量增加，1 d明顯升高（P＜0.01），第 3天達到高峰（P＜0.01），從第 5天開始逐漸降低（P＜0.01），到14 d含量恢復正常（P＞0.05），見表 1。

表1 創傷后雙側大腦皮質伊文思藍含量變化（μg/g，±s）Tab 1 Changes of evans blue in bilateral cortex after traumatic brain injury（μg/g，±s）

表1 創傷后雙側大腦皮質伊文思藍含量變化（μg/g，±s）Tab 1 Changes of evans blue in bilateral cortex after traumatic brain injury（μg/g，±s）

與假手術組相比*P＜0.01

n666666對側皮質1.94±0.251.86±0.452.26±0.201.87±0.142.03±0.402.20±0.261.660傷側皮質3.67±0.6824.01±1.38*29.62±1.28*13.09±1.06*7.27±0.92*4.28±0.54681.559組別假手術組腦創傷組 1 d 3 d 5 d 7 d 14 d F

2.3 腦水含量的改變 傷側大腦半球腦水含量組間比較有統計學意義（P＜0.01），對側組間比較無統計學意義（P＞0.05）。與假手術組相比，腦創傷組傷后1d腦水含量顯著增高（P＜0.01），3 d達高峰（P＜0.01），5 d逐漸降低（P＜0.05），7 d進一步降低，但未見統計學意義（P＞0.05），14 d 恢復正常（P＞0.05），見表2。

表2 創傷后雙側大腦半球腦水含量（%，±s）Tab 2 Changes of brain water content in bilateral cerebral hemisphere after traumatic brain injury（%，±s）

表2 創傷后雙側大腦半球腦水含量（%，±s）Tab 2 Changes of brain water content in bilateral cerebral hemisphere after traumatic brain injury（%，±s）

與假手術組相比 *P＜0.01，**P＜0.05

n666666對側半球77.06±0.6677.12±0.7977.52±0.5477.36±0.5177.18±0.4277.19±0.580.488傷側半球77.49±0.5379.30±0.44*80.89±0.48*78.40±0.47**77.78±0.2777.41±0.5350.973組別假手術組腦創傷組 1 d 3 d 5 d 7 d 14 d F

2.4 CD34+免疫組化結果 腦損傷后1、3 d傷側腦皮質CD34+細胞數與假手術組相比有所下降（P＜0.01），5 d開始增多并超過假手術組（P＜0.01），7 d和14d進一步增多（P＜0.01）。各組間比較有統計學意義（P＜0.01），見表 3。假手術組和腦創傷組 3、14 d 腦皮質CD34+陽性表達免疫組化結果見圖2。

表3 創傷后傷側腦皮質CD34+細胞數改變（±s）Tab 3 Changes of CD34+cells in injured cortex after traumatic brain injury（±s）

表3 創傷后傷側腦皮質CD34+細胞數改變（±s）Tab 3 Changes of CD34+cells in injured cortex after traumatic brain injury（±s）

與假手術組相比*P＜0.01

n666666傷側皮質10.49±0.846.34±0.68*7.84±0.72*17.10±0.59*24.79±1.05*26.81±0.67*775.159組別假手術組腦創傷組 1 d 3 d 5 d 7 d 14 d F

圖2 假手術組和TBI組CD34+陽性表達免疫組化圖(×40)Fig 2 Immunohistochemistry levels of CD34+cells in control group and TBI group(×40)

2.5 相關性分析 創傷性腦損傷后損傷側腦皮質聚集的CD34+細胞數與損傷側腦皮質伊文氏藍含量呈負相關（r=-0.840，P＜0.01）；與損傷側腦水含量呈負相關（r=-0.957，P＜0.01）。

3 討論

CD34+細胞是一類具有自我更新、多向分化及重建造血和免疫的生物學功能的內皮祖細胞[6]。其在促進血管新生、組織修復、創傷愈合[7]等方面發揮著重要的作用。有報道指出，創傷性腦外傷后，骨髓中的CD34+干細胞快速動員至外周血中，這些細胞在趨化因子作用下趨化到損傷區域[3]。這與我們的實驗結果一致：大鼠腦創傷后損傷區域CD34+細胞在傷后5 d開始聚集，隨后逐漸增多。聚集的CD34+細胞最終分化為內皮細胞，形成新生血管[8]，促進腦功能的恢復[9]。

絕大多數創傷性腦損傷的死亡和病殘都與創傷后出現的繼發性腦損傷關系密切，而傷后血腦屏障的破壞及腦水腫是引起繼發性腦損傷的主要原因[10]。TBI后血腦屏障通透性的改變是參與腦水腫發生發展的重要因素[11]。在我們的實驗中發現創傷后腦水含量及血腦屏障通透性的高峰期均在傷后3 d，隨后隨著血腦屏障通透性下降腦水含量也逐漸恢復至正常水平。

有報道指出在腦外傷后CD34+細胞聚集的過程中伴隨著血管內皮生長因子（VEGF）和血管生成素等促血管生成因子[12]的分泌增加。其中VEGF能夠促進基質金屬蛋白酶9的活化，抑制緊密連接蛋白的表達從而增加血腦屏障的通透性，加重腦水腫[13]；而血管生成素-1（Ang-1）能夠維持血腦屏障血管穩定性，抑制炎癥反應及內皮細胞凋亡，對預防腦水腫有一定的作用[14]。由此可見腦外傷后CD34+細胞的聚集與腦水腫及血腦屏障通透性密切相關。我們通過相關分析發現創傷性腦損傷后損傷側腦皮質聚集的CD34+細胞數與損傷側腦皮質伊文思藍含量呈負相關，說明CD34+細胞對于降低血腦屏障通透性有一定的作用。分析其中可能的原因是隨著CD34+細胞聚集及其對內皮的修復，VEGF及Ang-2表達減少，Ang-1在大腦血管內皮的組分表達回到正常的水平[15]，Ang-1在干預內皮細胞的炎性反應及穩定血腦屏障通透性方面有著重要作用，而且它能夠降低由于VEGF引起的血腦屏障的通透[14]。進一步相關分析發現聚集的CD34+細胞數與損傷側腦水含量也呈負相關，說明CD34+細胞能夠通過影響血腦屏障通透性進而緩解腦水腫的發生。

腦外傷后急性期的治療已經日趨成熟，但是對于繼發性腦損傷的治療仍然存在挑戰。如何減輕腦水腫正成為治療繼發性腦損傷的關鍵靶點。目前CD34+干細胞移植促進血管新生正成為治療腦梗死[16]、創傷性腦損傷[17]等腦血管疾病的研究熱點，我們的實驗結果提示CD34+細胞移植可能在腦損傷后血腦屏障修復減輕腦水腫方面也發揮作用。

［1］Laker S R.Epidemiology of concussion and mild traumatic brain injury[J].PM R,2011,3（10）:354

［2］Gary A R，Neurological diseases in relation to the blood–brain barrier[J].J Cerebr Blood F Met,2012,32（7）:1139

［3］Guo X B,Liu L,Zhang M,et al.Correlation of CD34+cells with tissue angiogenesis after traumatic brain injury in a rat model[J].J Neurotrauma,2009,26（8）:1337

［4］Lippertgruner M,Maegele M,Pokorny J.Early rehabilitation model shows positive effects on neural degeneration and recovery from neuromotor deficits following traumatic brain injury[J].Physiol Res,2007,56（3）:359

［5］Kaya M,Palanduz A,Kalayci R,et al.Effects of lipopolysaccharide on the radiation-induced changes in the blood-brain barrier and the astrocytes[J].Brain Res,2004,1019（1/2）:105

［6］劉海英，李建峰，李洪均，等.人臍血CD34+細胞移植對局灶性腦缺血大鼠神經功能恢復的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復，2008，12（3）:451

［7］Lamping K.Endothelial progenitor cells:sowing the seeds for vascular repair[J].Circ Res,2007,100（9）:1243

［8］Grote K,Salguero G,Ballmaier M,et al.The angiogenic factor CCN1 promotes adhesion and migration of circulating CD34+progenitor cells:potential role in angiogenesis and endothelial regeneration[J].Blood,2007,110（3）:877

［9］Taguchi A,Nakagomi N,Matsuyama T,et al.Circulating CD34-positive cells have prognostic value for neurologic function in patients with past cerebral infarction[J].J Cerebr Blood F Met,2009,29（1）:34

［10］Higashida T,Kreipke C W,Rafols J A,et al.The role of hypoxiainducible factor-1α,aquaporin-4,and matrix metalloproteinase-9 in blood-brain barrier disruption and brain edema after traumatic brain injury[J].J Neurosurg,2011,114（1）:92

［11］耿藝，劉榮耀，王健，等.水通道蛋白4在創傷性腦水腫中的表達及其對血腦屏障通透性的影響[J].中華臨床醫師雜志（電子版），2009，3（5）:38

［12］Gong D S,Zhang S,Liu L,et al.Dynamic changes of vascular endothelial growth factor and angiopoietin-1 in association with circulating endothelial progenitor cells after severe traumatic brain injury[J].J Trauma,2011,70（6）:1480

［13］Schoch H J,Fischer S,Marti H H.Hypoxia induced vascular endothelial growth factor expression causes vascular leakage in the brain[J].Brain,2002,125（11）:2549

［14］Lee S W,Kim W J,Jun H O,et al.Angiopoietin-1 reduces vascular endothelial growth factor-induced brain endothelial permeability via upregulation of ZO-2[J].Int J Mol Med,2009,23（2）:279

［15］Nag S,Kapadia A,Stewartt D J.Review:Molecular pathogenesis of blood–brain barrier breakdown in acute brain injury[J].Neuropath App Neuro,2011,37（1）:3

［16］Liu H Y,Zhang Q J,Li H J,et al.Effect of intracranial transplantation of CD34+cells derived from human umbilical cord blood in rats with cerebral ischemia[J].Chin Med J（Engl）,2006,119（20）:1744

［17］Xue S,Zhang H T,Zhang P,et al.Functional endothelial progenitor cells derived from adipose tissue show beneficial effect on cell therapy of traumatic brain injury[J].Neurosci Lett,2010,473（3）:186