含飽和氫氣HC-A腎保存液減輕大鼠腎臟冷缺血再灌注損傷的研究

任恒昌 ，杜洪印 ，喻文立，劉 璐 ，徐如彬 ，于建健 ，王玉亮

（1.天津醫科大學一中心臨床學院麻醉科，天津300192；2.天津市第一中心醫院麻醉科，天津300192；3.天津市第一中心醫院手術中心，天津300192；4.天津市胸科醫院麻醉科，天津300051；5.衛生部危重病急救醫學重點實驗室，天津300384）

缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷引起的移植腎功能障礙是影響同種異體腎移植手術治療效果的重要因素。氧化應激是I/R損傷產生的重要機制。大量細胞毒性氧自由基的產生可引起脂質和DNA的氧化損傷，產生炎癥反應，導致腎臟細胞的壞死和凋亡；而壞死細胞釋放的各種炎癥因子會進一步加重炎癥反應，形成惡性循環。因此，減輕細胞毒性氧自由基介導的氧化損傷可能成為改善術后移植腎功能的有效手段。研究表明，氫氣具有顯著的選擇性抗氧化作用，通過各種給藥途徑（吸入、靜脈或腹腔注射含氫生理鹽水等）進入實驗動物體內后，均能減輕腦、脊髓、心臟和肺臟等器官的I/R損傷[1-3]。近幾年，氫氣在移植器官保存中的保護作用受到了越來越多的重視。Buchholz等[4]的研究證明在小腸移植的大鼠模型中，含氫的UW液對移植的小腸具有抗氧化、抗炎癥的作用，而含氫的腎保存液對移植腎的I/R損傷是否具有保護作用卻尚未見報道。本研究采用Takada等[5]報道的大鼠腎臟冷I/R損傷模型，旨在觀察含飽和氫氣的HC-A腎保存液對大鼠腎臟冷I/R損傷的影響，為臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 HC-A離體腎保存液（上海長征醫院）；0.7 mm×19.0 mm的動脈留置針（美國BD公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性試劑盒（南京建成生物工程有限公司）；半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白-3（caspase-3）活性試劑盒（美國US Biological公司）；全自動生化分析儀（瑞士Roche公司）；Microfuge 22R Centrifuge離心機（美國Beckman coulter公司）；RM2016病理切片機（美國Leica公司）。

1.2 含飽和氫氣HC-A離體腎保存液的制備 本研究參照Ohsawa等[6]介紹的方法制備含飽和氫氣的HC-A離體腎保存液。抽取4℃HC-A離體腎保存液200 mL充入一真空的密閉容器內，向容器內充入氫氣，維持0.4 MPa的壓力，6 h后腎保存液中的氫氣接近于飽和，采用氣相色譜分析法測定其中氫氣的濃度，確保氫氣的濃度大于0.60 mmol·L-1，制備后的腎保存液于4℃常壓保存，于2 d內使用。

1.3 動物分組及模型建立 健康雄性Wistar大鼠24只（中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心），周齡8~10周，體質量200~250 g，采用隨機數字表法分為3組（n=8）。（1）對照組（H1組）：腹腔注射5%的水合氯醛溶液（60 mg·kg-1）麻醉大鼠，經腹部脫毛及碘伏消毒后，鋪無菌手術單，沿腹正中線逐層打開腹腔，鈍性游離雙側腎臟，切除右腎后用溫生理鹽水沖洗腹腔，縫合腹部切口。術中鋪加溫毯，監測大鼠肛溫，維持大鼠體溫高于37.0℃；（2）普通腎保存液組（H2組）：麻醉方法及開腹操作同H1組，開腹后充分游離雙側腎動、靜脈，切除右腎，鈍性分離左側腎蒂上下方的腹主動脈和下腔靜脈。用無損傷血管夾在左腎動脈開口上、下方阻斷腹主動脈，在左腎靜脈開口上、下方阻斷下腔靜脈，用0.7 mm×19.0 mm的動脈留置針行腹主動脈插管，拔出針芯并結扎固定套管，作為灌注通路；在下腔靜脈上做一約3 mm的缺口作為流出通路。用4℃普通HC-A腎保存液通過腹主動脈套管對左腎行原位冷灌注，用吸引器及時吸凈流出的血液和保存液，灌注液總量10 mL，在2~3 min內完成灌注。灌注完成后在近左側腎門處夾閉左腎動、靜脈45 min，阻斷期間用7-0血管線縫合腹主動脈和下腔靜脈的缺口，隨即移除腹主動脈和下腔靜脈的血管夾。45 min后移除左腎腎蒂上的血管夾，恢復左腎血流，用溫生理鹽水沖洗腹腔后關腹；（3）含飽和氫氣腎保存液組（H3組）：麻醉及手術操作同H2組，灌注液及保存液采用自制的含飽和氫氣的HC-A腎保存液，按同樣方法灌注后關腹。

1.4 樣本的采集和觀察指標的測定

1.4.1 腎功能檢查 H1組大鼠于切除右腎24 h后，H2和H3組于再灌注24 h后經下腔靜脈取血2 mL，4000 r/min離心5 min，檢測各組大鼠血清BUN和Cr的濃度以評價腎功能。

1.4.2 氧化應激和細胞凋亡檢測 抽取靜脈血標本后立即處死大鼠，切取左腎，取左腎背面上半個腎組織，剝除結締組織后在4℃生理鹽水中沖洗干凈，稱取0.5 g腎臟組織塊，與生理鹽水4.5 g制作組織勻漿，采用MDA含量和SOD活性試劑盒測定組織勻漿中MDA含量和SOD活性以評價氧化應激的水平；比色法檢測caspase-3活性以評價細胞凋亡的水平，具體操作按試劑盒說明進行。

1.4.3 形態學檢查 取左腎同一部位的部分腎組織，用10%甲醛溶液固定后石蠟包埋后，切成4 μm薄片，行HE染色后于光學顯微鏡下觀察腎組織形態結構的改變。

1.5 統計學處理 應用SPSS18.0統計軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎功能檢查 如表1所示，與H1組相比，H2、H3組BUN和Cr水平升高（P<0.05）；與H2組相比，H3組BUN和Cr水平降低（P<0.05）。

表1 各組大鼠血清中BUN、Cr水平（±s）Tab 1 Levels of BUN and Cr in H1，H2and H3groups（±s）

表1 各組大鼠血清中BUN、Cr水平（±s）Tab 1 Levels of BUN and Cr in H1，H2and H3groups（±s）

與 H1組比較，abP<0.05；與 H2組比較，bP<0.05

組別nBUN（/mmol·L-1）Cr（/μmmol·L-1）H185.77±1.2450.69±7.13 H2817.91±1.45a155.62±8.23a H3810.76±0.97ab106.01±7.74ab

2.2 氧化應激和細胞凋亡檢測 如表2所示，與H1組相比，H2、H3組腎組織中 MDA含量和 caspase-3活性升高（P<0.05），SOD活性降低（P<0.05）；與H2組相比，H3組腎組織中MDA含量和caspase-3活性降低（P<0.05），SOD活性升高（P<0.05）。

表2 各組大鼠腎組織中MDA含量和SOD、caspase-3活性（±s）Tab 2 MDA level,SOD and caspase-3 activity in renal tissue inH1,H2and H3group（±s）

表2 各組大鼠腎組織中MDA含量和SOD、caspase-3活性（±s）Tab 2 MDA level,SOD and caspase-3 activity in renal tissue inH1,H2and H3group（±s）

與 H1組比較，abP<0.05；與 H2組比較，bP<0.05

組別nMDA（/nmol·mg蛋白-1）SOD（/NU·mg蛋白-1）caspase-3活性H186.00±1.18132.36±5.071.00±0.20 H2816.87±1.04a62.52±5.23a1.58±0.31a H389.71±1.00ab100.27±7.19ab1.31±0.01ab

2.3 形態學檢查 各組大鼠腎組織經HE染色后于光鏡下觀察結果，如圖1所示：H1組腎組織形態結構未見明顯異常；H2組可見大量腎小管上皮細胞腫脹，出現明顯空泡，上皮細胞壞死脫落，腎小管結構破壞；H3組病理改變較H2組明顯減輕，腎小管的病理改變以擴張為主，僅少數腎小管上皮細胞出現空泡，未見明顯的結構破壞。

圖1 各組大鼠腎組織形態學改變（HE，×200）Fig 1 The pathological changes of kidney in H1,H2and H3groups(HE,×200)

3 討論

移植腎在恢復血液灌注后會不可避免地產生I/R損傷。在手術過程中，移植腎先后經歷了熱缺血和冷缺血的過程，大量實驗研究采用了夾閉大鼠腎動脈一段時間后再開放的實驗模型，即熱I/R損傷模型，因為缺少了冷缺血的過程，所以這些模型更適合于休克的研究，不能很好地模擬腎移植過程；而對于大鼠腎移植模型，因需要進行血管吻合，操作復雜，術后血管狹窄、血栓形成等并發癥多，同時增加了排斥反應的干擾。本研究所選用的大鼠冷缺血再灌注模型是以Takada等報道的原位腎臟冷灌注模型為基礎，增加了冷缺血過程，相對于大鼠腎移植模型具有操作簡單、血管損傷少、體循環影響小以及避免排斥干擾等優點，能較好地模擬大鼠腎移植的I/R過程。

氫氣是具有還原性的雙原子氣體，分子量小，電荷中性，且具有良好的脂溶性，容易透過各種生物膜。2007年，Ohsawa等[6]首次報道氫氣能夠選擇性地與羥自由基（OH·）和過氧亞硝酸陰離子（ONOO-）發生直接反應，具有選擇性抗氧化的生物效應。由氧自由基介導的氧化損傷和炎性損傷是導致I/R損傷的主要病理基礎之一。I/R過程中，氧自由基生成增多，在介導氧化損傷的氧自由基中，以OH·和ONOO-的毒性最強，是導致I/R損傷的重要介質。本研究結果顯示，與普通腎保存液組相比，含飽和氫氣腎保存液組MDA水平降低，SOD活性升高，提示應用含飽和氫氣腎保存液后大鼠腎臟的氧化應激水平降低，可能是由于氫氣的選擇性抗氧化作用，使得OH·和ONOO-數量減少，從而減輕了由其引發的氧化損傷。

腎小管上皮細胞凋亡是腎功能損害的重要環節，與多種腎臟疾病的發生發展有關。capase-3是細胞凋亡過程中的一個關鍵酶，在腎小管上皮細胞的凋亡中起重要作用，其活性的高低能間接反映組織細胞的凋亡程度。本研究的結果顯示，與普通腎保存液組相比，含飽和氫氣腎保存液組的腎組織中caspase-3活性明顯降低，提示細胞凋亡水平降低，同時腎功能也明顯改善，光鏡下觀察腎小管上皮細胞的損傷和腎小管結構破壞的程度亦明顯減輕。在腎臟I/R損傷過程中，氧自由基可激活多種炎癥細胞，釋放大量促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-1β（IL-1β）等[7]。增多的炎性因子誘導中性粒細胞的活化和遷移滲透，從而引起腎臟局部及全身的炎性反應，導致腎小管上皮細胞的壞死和凋亡。有報道稱，TNF-α對腎臟近端腎小管上皮細胞的活性有明顯抑制作用并呈劑量依賴性，最終可導致細胞凋亡[8]。IL-6在腎臟再灌注后的炎性損傷中同樣具有重要作用。腎小管上皮細胞、單核細胞、中性粒細胞以及部分T淋巴細胞、B淋巴細胞都表達IL-6受體，I/R過程中大量的IL-6與受體結合后能引起腎小管上皮細胞的凋亡，同時活化上述免疫細胞，加重組織損傷[9]。有臨床研究也證明，IL-6能明顯加重腎移植過程中的腎臟的I/R損傷[10]。Janus激酶/信號轉導子和轉錄激活子（JAK/STAT）信號通路是TNF-α和IL-6導致細胞凋亡的共同途徑，二者與腎小管上皮細胞的相應受體結合后促進凋亡相關分子capase-1和capase-3等表達增多，繼而誘導細胞的凋亡。結合本研究的結果，氫氣減輕腎小管上皮細胞凋亡可能是通過作用于上述信號通路而實現的。氫氣的選擇性抗氧化作用清除了大量具有細胞毒性的氧自由基，并減輕了由其引發的炎癥反應，促炎細胞因子的釋放減少，使JAK/STAT信號通路介導的腎小管上皮細胞凋亡程度明顯減輕。

綜上所述，氫氣用于移植腎臟的灌注和保存時表現出明顯的抗氧化和抗凋亡的作用，同時HC-A離體腎保存液是國內腎移植手術時常用的器官保存液，用其制備含飽和氫氣的腎保存液過程簡單，成本低廉，有望為移植器官的保存提供新的途徑。

［1］Huang Y,Xie K L,Li J P,et al.Beneficial effects of hydrogen gas a gainst spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits[J].Brain Res,2011,1378（5）:125

［2］Hayashida K,Sano M,Ohsawa I,et al.Inhalation of hydrogen gas reduces infarct size in the rat model of myocardial ischemia-reperfusion injury[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,373（1）:30［3］Tomohiro K,Huang C S,Naobumi T,et al.Inhaled hydrogen gas therapy for prevention of lung transplant-induced ischemia/reperfusion injury in rats[J].Transplantation,2010,90（12）:1344

［4］Buchholz B M,Masutani K,Kawamura T,et al.Hydrogen-enriched preservation protects the isogeneic intestinal graft and amends re cipient gastric function during transplantation[J].Transplantation,2011,92（9）:985

［5］Takada M,Nadeau K C,Shaw G D,et al.The cytokine-adhesion molecule cascade in ischemia/reperfusion injury of the rat kidney.Inhibition by a soluble P-selectin ligand[J].J Clin Invest,1997,99（11）:2682

［6］Ohsawa I,Ishikawa M,Takahashi K,et al.Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals[J].Nat Med,2007,13（6）:688

［7］Jo S K,Sung S A,Cho W Y,et al.Macrophages contribute to the initiation of ischemic acute renal failure in rats[J].Nephrol Dial Transplant,2006,21（5）:1231

［8］Al-Rasheed N M,Willars G B,Brunskill N J.C-peptide signals via galphai to protect against TNF-a-mediated apoptosis of opos sum kidney proximal tubular cells[J].J Am Soc Nephrol,2006,17（4）:986

［9］Nechemia-Arbely Y,Barkan D,Pizov G,et a1.IL-6／IL-6R axis playsacriticalroleinacutekidneyinjury[J].JAmSocNephrol,2008,19（6）：1106

［10］Domanski L,Pawlik A,Safranow K,et al.Purine and cytokine concentrations in the renal vein of the allograft during reperfusion[J].Transplant Proc,2007,39（5）:1319