多靶標基因并行檢測技術為腫瘤個體化治療提供新模式

蔡貞 鄭磊

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多靶標基因并行檢測技術為腫瘤個體化治療提供新模式

蔡貞 鄭磊★

隨著人類基因組學和藥物基因組學的發展，腫瘤個體化診療已由愿景變成了現實。腫瘤的發生發展是一個多基因參與、多信號通路激活的復雜生物學過程，多靶標并行檢測可一次同時對多個腫瘤個體化診療相關靶標進行檢測，為臨床醫生制定適宜的個體化診療方案提供更為全面的信息。本文僅就近年出現的可實現多靶標并行檢測的主要技術-液相芯片技術和新一代測序技術做簡要的述評，并簡述多靶標并行檢測在質量控制方面應遵循的基本原則。

腫瘤；個體化診療；多靶標并行檢測技術

1 腫瘤個體化診療

近20年我國惡性腫瘤的發病率升高約50%，成為疾病死亡原因之首。雖然惡性腫瘤診治近年來已取得長足的進展，但大部分腫瘤患者預后情況仍無顯著改善。手術切除、局部放療和輔助化療聯合應用仍是惡性腫瘤的主要治療手段。傳統的腫瘤化療用藥方案主要根據患者罹患腫瘤的臨床分期和病理分型制定，劑量的個體化差異則根據體重、體表面積、肝腎功能等做相應的調整。這種用藥策略對不同患者產生的治療效果可分為四種：治療有效而無副作用；有效有副作用；無效也無副作用；無效而有副作用。對于無效或存在嚴重副作用的患者，往往存在一個確診、試藥、換藥、再換藥的過程，這樣不僅造成病情延誤，還增加了患者承受毒副作用及經濟損失的幾率。隨著腫瘤生物學研究的進展，一些與抗腫瘤藥物療效相關的靶信號通路、靶點基因甚至某一基因的多態性位點逐漸明確，推動了腫瘤個體化治療的發展。

腫瘤個體化治療是指在患者確診后進行藥物療效相關的基因檢測，根據基因檢測的結果確定個體化治療方案。美國國家綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）發布的幾種惡性腫瘤臨床實踐指南中已明確提到對于惡性腫瘤的病理學評估不僅要確定組織學類型、侵犯范圍、明確手術切緣情況等，還需要進行必要的分子學診斷檢查，目的是確定是否存在特定的基因突變（如EGFR、K-ras等）以選擇靶向藥物治療的適宜人群，或對患者選擇適宜的治療方法提供參考。但在臨床實踐中，腫瘤醫生仍常常感到困惑：“我們知道每個患者不一樣而且需要進行個體化治療，但我們怎樣能知道他們有什么不一樣，又如何根據這些不一樣來實施個體化治療？”隨著人類基因組學和藥物基因組學的發展，腫瘤“分子分型”概念被廣泛認可，并在腫瘤個體化治療中發揮著越來越重要的作用。與傳統的病理分型不同，惡性腫瘤分子分型是根據基因特征將患者進行分類。以肺癌為例，傳統病理分型根據組織細胞形態分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），后者又可分為腺癌、鱗癌和大細胞癌等；而分子分型則根據EGFR、K-ras、ALK融合基因狀態，將患者分為不同的亞群，如圖1。針對不同分子分型的肺癌實施針對性治療，可顯著地提高治療有效率[1～2]。MD Anderson腫瘤研究中心就肺癌個體化治療開展的數個大型前瞻性臨床研究均顯示了個體化治療的可行性及優勢[3～4]。

2 多靶標并行檢測的必要性

腫瘤的發生發展是一個多因素作用、多基因參與、多信號通路激活的極其復雜的生物學過程。近年的腫瘤基因研究發現，每個腫瘤均可通過靶標檢測明確其驅動變異基因，根據變異基因即可將患者歸為某分子亞型，從而針對性實施治療[5～7]。靶向藥物（targeted medicine）針對腫瘤基因開發，通過與癌癥發生、腫瘤生長所必需的特定分子靶點的作用，阻斷腫瘤細胞內控制細胞生長增殖的信號傳導通路殺滅癌細胞，阻止其進展，是目前最先進的用于治療癌癥的藥物。靶向藥物通過特定靶位發揮治療作用的本質特性，決定了任何一種靶向藥物只對部分患者有效。靶標基因檢測是篩選適合特定靶向藥物治療患者的重要手段，已成為實施腫瘤個體化治療的必需部分，但靶向藥物療效產生影響的因素往往涉及到某一特定信號通路中的多個關鍵基因。在一項對747位接受西妥昔單抗治療的結直腸癌患者EGFR通路基因突變進行檢測的研究中，研究者檢測了包括K-ras、BRAF、NRAS和PIK3CA共71種突變。結果表明患者總緩解率為24.4%，而K-ras、BRAF、NRAS和PIK3CA均為野生型患者的緩解率為41.2%[8]，這一結果表明通過檢測EGFR通路系列靶標檢測結果篩選，能使西妥昔單抗的有效率提高近70%；與檢測單一靶標相比較，檢測信號通路所有成員，對實施個體化治療更有指導意義。而對于NSCLC患者，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）厄洛替尼和吉非替尼是目前治療NSCLC臨床應用最廣的靶向治療藥物，患者肺癌細胞EGFR基因突變狀態是這類藥物療效的決定因素。根據NCCN非小細胞肺癌臨床實踐指南，NSCLC患者EGFR突變陽性者應首選TKIs藥物治療，而EGFR野生型，選用細胞毒化療。但肺癌細胞如存在K-ras基因突變會導致TKIs治療耐藥狀態，如明確患者存在K-ras突變，則需考慮厄洛替尼以外的治療方法。此外，NSCLC患者中還存在EML4-ALK突變亞群，EML4-ALK突變陽性患者雖然對EGFR-TKIs耐藥，但ALK抑制劑如克唑替尼對這類患者的一種很有效的治療策略，顯示出非常高的疾病控制率（約90%）。故而NCCN指南中明確建議NSCLC患者進行靶向治療應檢測以下幾種生物標記物，包括：EGFR、K-ras、EML4-ALK融合癌基因等；此外ERCC1、RRM1等基因mRNA表達水平等可作為化療療效預測標記物[9～11]。綜上而知，單一檢測某項靶標對患者接受治療的指導意義存在明顯局限，通過多通路多靶標并行檢測獲得每位患者腫瘤的全面基因信息，才能為患者制定出針對這些驅動基因的最佳藥物組合，如圖1所示[12～24]。隨著腫瘤信號通路研究的深入，將有更多與藥物療效相關的靶標被揭示，并使藥物治療效率進一步提高。

圖1 肺癌個體化治療分子分型Figure 1 Molecular pathology of non-small cell lung cancer

3 多靶標并行檢測技術平臺

目前常用的基因突變檢測技術有測序法、DHPLC法、ARMS法和生物芯片技術等。其中第一代測序技術、ARMS、DHPLC等都無法實現多個靶標并行檢測而只能分開多次進行，這樣會導致以下問題出現：（1）使用樣本量成倍遞增；（2）增加系統誤差；（3）檢測過程耗時，且費用昂貴，難以實現規模化。生物芯片技術（biochip/bioarray）和新一代測序技術（next generation sequencing，NGS）的發展使得多種腫瘤個體化診療相關靶標并行檢測得以實現。

3.1 生物芯片技術

生物芯片是20世紀90年代中期以來影響最深遠的重大科技進展之一，其原理是根據生物分子間特異性的相互作用，將生化分析過程集成于芯片表面，從而實現對DNA、RNA、多肽、蛋白質以及其他生物成分的高通量快速檢測。根據載體性質的不同，可分為固相芯片技術和液相芯片技術。前者是將多種待測分子靶標預置在一款很小的固相支持物上，用于俘獲被測血清中對應的待測分子，通過檢測雜交信號，對生物細胞或組織中檢測分析的信息進行定量分析。第一張進入臨床檢查的是Amplichip CYP450 SNP檢測芯片，于2005年通過了FDA批準進入臨床使用，用來檢測患者體內決定細胞色素氧化酶活性的多態性位點以預測患者藥物代謝水平的高低。目前固相芯片的制備逐漸走向高通量、微量化和自動化，其檢測下限也已達到納克級總RNA水平。這為多靶標并行檢測研究，即在同一個芯片載體上平行地進行多個序列的雜交提供了可能。此外，芯片矩陣面積的微量化也減少了樣品用量，大大減少了系統和批次可能帶來的差異。

液相芯片（liquid chip) 則以熒光微球為載體，集合流式細胞技術、激光技術、數字信號處理技術及傳統芯片技術于一體，由美國Luminex公司首先提出并研制成功。該技術利用包覆不同比例紅光及紅外光發色劑產生的幾百種不同比例顏色（熒光編碼）的聚苯乙烯微珠（直徑5.5～5.6 μm），通過標定特定抗體、核酸探針與各種受體等，與biotin標記的待測樣本反應后，逐個通過檢測通道并使用雙色激光檢測：紅色激光激發微珠基質上的紅色分類熒光，根據微珠中的熒光編碼分類，鑒定各個不同的反應類型（即定性）；綠色激光則激發綠色報告熒光分子，確定微珠上結合的報告熒光分子數量來確定目的分子數量（即定量），最終對靶標實現實時、定性和定量分析。與固相芯片相比，液相芯片具有操作簡便，標本用量少、線性范圍廣、準確度高的優點。此外，液相芯片還可根據臨床的需要自由選擇不同的檢測靶標進行組合[25]。目前基于其開發的應用于腫瘤個體化診療的技術包括分支DNA液相芯片技術、xTAG液相芯片技術和MEL液相芯片技術。其中分支DNA液相芯片技術直接采用樣品裂解液檢測待測RNA分子含量，與傳統的基因mRNA檢測技術-逆轉錄PCR相比，省略了DNA提取、逆轉錄及目標片段擴增等步驟，降低了操作過程或多步驟誤差積累對結果的影響，對于FFPE樣品尤其適用[26，27]。分支DNA液相芯片可一次并行檢測36種靶標，主要用于化療療效相關基因RNA表達水平檢測和腫瘤預后相關靶標檢測[28～30]。xTAG-液相芯片技術可同時檢測體細胞基因突變和基因多態性，具有靈敏度高、特異性好和損耗樣本量少等特點，適用于各種組織樣本和全血樣本等。xTAG-液相芯片技術一次反應可同時檢測96個樣本的70個等位基因，最低可檢測占野生型拷貝數1%的突變片段[31,32]。MEL（突變富集）液相芯片技術檢測則特別適用于胸水、血漿等樣本中游離腫瘤DNA或經顯微切割的組織切片樣本的體細胞突變檢測[33]，最低可檢測占野生型拷貝數0.1%的突變片段。

3.2 新一代測序技術

DNA測序技術始于上世紀七十年代，由于測序技術可較直觀地分辨出基因的核酸突變、插入和重排等變異，在檢測靶基因的核酸序列中具有獨特的優勢，在腫瘤靶向藥物的選擇與分子分型等領域已得到廣泛應用。第一代測序技術即雙脫氧鏈末端終止法或稱Sanger測序法是目前應用最為廣泛的DNA測序技術，具有讀序列能力較長（大于1 000 bp）、準確率高（可以達到99.99%）、操作與結果分析簡易等優點。其缺點是操作步驟繁瑣，技術要求高，且要求檢測樣本中基因突變達到一定比例方可檢出。經過30多年的發展，測序技術也經歷了技術的演變。近年開展的如火如荼的新一代測序技術以一次能并行對幾百萬到十億條DNA分子進行序列測定為特點，亦為多靶標并行檢測提供了技術平臺[34]。高通量測序平臺的代表有羅氏公司的454測序儀、Illumina公司的Solexa基因組分析儀、ABI的SOLID測序儀和Ion Torrent系統，以上幾種測序技術依賴PCR擴增的信號放大過程，基于邊合成邊測序的原理，突出特點是測序的高度平行化，成千上萬個測序反應可在同一系統內同時進行，且反應體系非常小，可在短時間內獲得大量的核酸序列信息。以454測序技術為例，其基本原理是：首先將核酸樣本打斷成數百bp的片段，通過在其末端接上接頭形成樣品文庫，并與特別設計的磁珠相連接，此時每個磁珠攜帶有獨特的核酸片段，再將磁珠進行乳化PCR反應（Emulsion PCR），那么每個DNA片段將形成一個獨立的核酸擴增反應，最后再將帶有擴增產物的磁珠放入特定的微孔板中進行焦磷酸測序與數據分析。2010年面市的Ion torrent測序平臺則基于半導體技術原理而非光學原理進行測序，為全球首個后光學時代的基因組測序平臺[35]。而Helicos公司的Heliscope技術、Pacific Biosciences公司的SMRT技術被譽為第三代測序技術，真正實現了無需文庫構建的單分子測序，不但簡化了基因組測序的流程，且大大降低了所需樣品的量。隨著高通量測序技術的發展與逐漸成熟，科學家們不斷在基因組水平上對疾病進行更深入的研究探索，并已在一些罕見病、遺傳病和癌癥的診斷治療中取得突破，相信在不久的將來，高通量測序技術將會為個體化醫療提供更豐富有力的診療信息。

4 多靶標檢測的質量控制

多靶標檢測往往包括基因擴增PCR和核酸雜交過程，其質量控制應遵循臨床檢驗，特別是臨床基因擴增實驗室的質控原則進行質量控制和質量管理。除此之外，多靶標檢測還有一些特殊的質量控制考慮。分析前往往是樣本檢測中最難控制的環節。腫瘤靶標檢測的標本多為組織標本中的DNA或RNA分子，針對不同檢測方法不同檢測物質，對于標本采集、運送和采集的過程均有其特殊要求。如用于提取核酸的血液標本，通常要求使用EDTA抗凝的采血管，其它抗凝劑可能會對后續PCR擴增效率造成影響；又如檢測的靶核酸是RNA時，要求標本必須在保護液中保存運輸以免RNA降解[36]。所以必須建立標準化流程，并對標本采集和運送人員進行培訓。在分析過程中，質控品是及時發現檢測異常的監控手段，其合理設置尤為重要。檢測的各個關鍵過程均應設置質控樣本，包括核酸提取過程、檢測過程和關鍵儀器性能表現等[37～38]，此外由于檢測靶標的特殊，很多個體化診療靶標基因的表達水平在不同個體中原本就存在很大差異，加之應用檢測方法的不同，故而針對不同檢測靶標需設置嚴密合理的內參對照，包括不同種類、不同濃度的內參設置等以保證結果的可信性。腫瘤個體化診療相關靶標檢測的分析后質量控制，除了可以采用Levey-Jennings質控圖和Westgard多規則質控方法等常用統計學分析外，還可以定期回顧分析靶標突變率、靶標突變的人口學分布等指標是否在研究支持的合理范圍內。另外，由于個體化診療尚處于臨床發展初期，對于一些靶標與疾病或藥物療效的相關度仍需大樣本臨床觀察，尤其是針對國人的大樣本量數據。加強與臨床醫生的對話，與臨床醫生一同合理分析報告，對正確地運用檢測結果很重要。

5 結語

腫瘤治療正逐步進入個體化治療時代。近年來腫瘤相關靶標的研究進展非常迅速，新的檢測技術亦層出不窮。將新研究成果和先進技術轉化并服務于臨床，必須盡快建立規范、標準化的臨床檢測方法，并建立配套的質量控制體系。

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Multiple target gene detection technologies provide a new dimension for personalized cancer therapy

CAI Zhen, ZHENG Lei★
(Laboratory Medicine Center, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China)

Along with the development of human genomics and pharmacogenomics, the personalized diagnosis and treatment of cancer has translated from vision into reality. The occurrence and development of malignant tumors is a complicated biological process involving multiple genes and signaling pathways. Parallel detection technologies are capability of detection of multiple target genes simultaneously, which provide more comprehensive information for clinical doctors to make personalized treatment program. This article will briefly introduce the new developed multiple target genes parallel detection technology, liquidchip technology and next-generation sequencing technology and discuss the basic principles of quality control involved in these technologies.

Tumor; Personalized diagnosis and treatment; Parallel detection technology of multiple target genes

國家自然科學基金（81101609）；廣東省自然科學基金（S2011010003840）；廣東省醫學科研基金（A2013375）；國家特色專業臨床檢驗（TS2483）

南方醫科大學南方醫院檢驗醫學科，廣東，廣州 510515

★通訊作者：鄭磊，E-mail:nfyyzl@163.com