脂肪組織來源的干細胞體外培養隨機惡性轉化

劉桂英楊立業李文玉鄭佳坤陳輝陳強

脂肪組織來源的干細胞體外培養隨機惡性轉化

劉桂英1楊立業2,3★李文玉2鄭佳坤3陳輝2陳強2

目的 研究脂肪來源干細胞在體外能否惡性轉化。 方法 從小鼠脂肪組織培養出脂肪組織來源干細胞（ADSCs），觀察細胞是否發生惡性轉化，應用免疫細胞化學方法檢測轉化細胞的相關標志物的表達，并對其染色體結構進行分析，并將轉化細胞移植到裸鼠皮下以檢測其成瘤性。 結果 1個培養瓶中的細胞在體外培養4個月左右發生了轉化，已經永生化，目前體外培養超過100代，細胞仍維持原來的增殖速度。細胞表達中胚層的標志物vimentin，但不表達pan-CK，說明其是間充質來源；同時表達PCNA、Ki67和VEGF-c，不表達p16；染色體分析證明為非整倍體，有廣泛的易位；透射電鏡下可見細胞表面微絨毛結構；細胞在軟瓊脂中沒有克隆形成能力；裸鼠皮下移植能夠形成腫瘤組織，腫瘤組織的主體成分為肉瘤。 結論 脂肪組織來源的干細胞在體外長期培養能夠發生惡性轉化，裸鼠皮下移植能夠形成肉瘤。

肉瘤；脂肪組織來源干細胞；惡性轉化；干細胞；永生化

體外培養的腫瘤細胞是研究腫瘤生物學特性、癌變機理和癌癥治療的良好生物學模型，細胞系的建立允許詳細分析生物學、形態學、抗原性和細胞原性的特征。傳統的腫瘤細胞系建立方法是應用獲得的腫瘤組織進行培養，或者將外源性的基因導入細胞，如端粒酶基因[1]、SV40大T抗原[2]、myc基因[3]和Ras基因等[4]，細胞才能長期存活，獲得不死性。

脂肪組織中存在干細胞，稱為脂肪組織來源的干細胞（adipose tissue-derived stem cells，ADSCs）在體外可以長期培養，具有多種方向的分化能力，是組織工程研究中的一種重要的種子細胞[5]。我們對小鼠的ADSCs進行長期培養，觀察細胞能否惡性轉化，及細胞惡性轉化后的特性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

Balb/C小鼠購自中山大學實驗動物中心，Balb/C裸鼠購自廣州中醫藥大學實驗動物中心。

1.2 ADSCs分離培養

采用頸椎脫臼法處死Balb/C小鼠，以750 mL/L乙醇浸泡5 min；無菌條件下取其腹膜外脂肪組織，用緩沖液反復沖洗，剪刀剪碎，0.125% 膠原酶，37℃消化45 min，在消化過程中用吸管反復吹打，1 500 r/min離心10 min，最上層為成熟的脂肪組織，棄去脂肪組織和上清，沉淀成分為基質血管層（stromal vascular fraction，SVF），160 mmol/L的NH4Cl裂解SVF中的紅細胞10 min，離心棄上清；DMEM培養基重懸細胞，篩網過濾離心，棄上清。DMEM培養基重懸細胞，培養基中含有2 mmol/L 谷氨酰胺、10%的胎牛血清（FBS）、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素，種植于培養瓶中，密度約為8 000～20 000個/mL，放入37℃、5% CO2及飽和濕度培養箱中培養。24 h后倒掉原來的培養基，去除未貼壁的紅細胞和殘渣，剩余貼壁細胞能夠增殖、傳代即為ADSCs。每 2～3 d換液一次， 約 7～10 d細胞達80%～90%融合時，0.25%胰酶消化傳代[5,6]。

1.3 細胞系的維持、凍存與復蘇

取對數生長期細胞，0.25%胰酶和0.02% EDTA消化細胞5 min，收集細胞，1 000 rpm離心5 min，用培養液重懸細胞，1瓶細胞分種2瓶，同時凍存適量細胞，凍存液為培養液，含有10%二甲基亞砜，放入液氮罐中或超低溫冰箱中保存。細胞復蘇時，將盛有細胞的冷凍管從液氮或超低溫冰箱中取出，37℃水浴，使細胞融化、離心、棄上清，將預溫至37℃、含有10%血清的培養液加入離心管中重懸細胞，置于37℃、5% CO2及飽和濕度的培養箱中培養。

1.4 形態學觀察

1.4.1 染色

將細胞接種于放有蓋玻片的小平皿中，長成單層，經PBS洗滌后，用4%多聚甲醛固定，做常規HE染色及免疫組化染色。

1.4.2 電子顯微鏡

將細胞接種于25 cm2培養瓶中，接種后第2天，將培養瓶中的細胞消化，離心，沉淀的細胞團用2.5%戊二醛及1%鋨酸雙固定，Epon 812包埋，超薄切片，染色，在JEM-1010透射電鏡下觀察（吉林大學醫學院電鏡室）。

1.5 軟瓊脂細胞克隆形成

采用雙層瓊脂糖培養法，先將1%瓊脂糖與預溫至37℃的2×DMEM等體積混合均勻，澆入75 mL培養瓶中，5 mL/瓶，置室溫使瓊脂凝固；取對數生長期細胞，制備細胞懸液，與1%瓊脂混合均勻，制備成含細胞的0.3%瓊脂培養基，澆入鋪有底層瓊脂的培養瓶，使細胞濃度分別為100個/mL、1 000個/mL、10 000個/mL，將培養瓶移入CO2培養箱，置于37℃、5% CO2及飽和濕度環境下培養，于2周左右計數集落形成率，實驗重復5次。

1.6 染色體分析

取對數生長期細胞，加入終濃度為0.04 μg/mL的秋水仙素，5% CO2、37℃孵育2 h，吸出培養液，用0.25%胰酶消化細胞，離心1 500 rpm，8 min，棄上清，加入0.075 M KCl，37℃水浴20 min，離心棄上清，加入新鮮配制的固定液（甲醇∶冰醋酸 = 3∶1），室溫固定10 min，離心后棄上清，重復固定一次，滴片，室溫干燥，進行Gemsa染色，計數100個分裂中期的染色體，進行核型分析。

1.7 免疫細胞化學染色

應用SP法檢測pan-CK、SMA、vimentin、desmin、ferritin、VEGF-c、p16、Ki67和PCNA在細胞中的表達，AEC顯色，結果拍照留底。SP-9000試劑盒為北京中杉金橋公司產品，所有抗體由Santa Cruz公司產品（北京中杉金橋公司代理）。實驗至少重復3次以上。設置陰性對照：用0.01 mol/L PBS替代一抗。

1.8 裸鼠成瘤實驗

取對數生長期細胞（第37代細胞），制備成細胞懸液接種裸鼠，接種量1×106～2×106細胞/只，皮下接種裸鼠11只。觀察成瘤率、腫瘤潛伏期。在腫瘤接種后1～3個月，照相后處死，取出腫塊作病理組織學檢查。對所有裸鼠全身重要臟器進行病理學檢查，注意有無局部淋巴結及全身轉移。

2 結果

2.1 ADSCs的特點

原代培養的ADSCs約于接種數小時后逐漸貼壁，貼壁細胞初為類圓形，細胞大小不等，接種后24 h，體積較大的細胞很多已貼壁，并開始伸展，多呈梭形，少數細胞為多角形。1 周后，細胞漸達70%～80%融合。排列出現方向性，但有少量細胞由梭形漸變為橢圓形、圓形。此時可按1∶2進行常規傳代培養。傳代后細胞約于3～5 d可達85%融合，可再次進行消化傳代。我們的前期研究證實，用這種方法獲得的ADSCs具有多向分化的能力[5～7]。

2.2 ADSCs的惡性轉化

我們共進行了10次小鼠細胞的原代培養，8次原代培養成功，5例的細胞在體外培養不超過2個月，細胞就全部死亡；3次體外培養超過4個月的細胞中，有1次發生了細胞的自發轉化，發生惡性轉化的時間約在體外培養的第4個月，在培養瓶中發現部分細胞表現出腫瘤細胞的一些特征：細胞體積顯著增大，可觀察到大量處于分裂中期的細胞，細胞增殖速度明顯加快，倍增周期明顯縮短，約為20 h，細胞呈無限生長及增殖的態勢，且對血清的依賴性顯著下降，細胞極性及細胞間接觸抑制現象消失。

2.3 免疫細胞化學染色

轉化細胞表達pan-actin（圖1A）、vimentin（圖1B）和desmin（圖1C），部分細胞表達SMA（圖1D）；細胞也表達Ki67（圖2A）、PCNA（圖2B）、ferritin（圖2C）和VEGF-c（圖2D），pan-CK和p16在細胞中的無表達（未顯數據）。

2.4 細胞的超微結構

透射電鏡下可見：細胞大小均勻，呈圓形，表面可見微絨毛結構，核呈圓形或不規則形狀，細胞核明顯增大，多為單核，偶見2個核細胞，可見核分裂相，核膜可有內陷或外凸，核的形態不規則，核異染質增多，凝集成塊狀或聚集在核膜下，核仁增大，數目增多，形狀和位置不規則，細胞中可見較多脂滴樣結構（圖3A）。

圖1 惡性轉化的ADSCs表達肌肉細胞的標志物Figure 1 The malignantly transformed ADSCs were stained by muscle markers

圖2 惡性轉化細胞表達腫瘤細胞的標志物Figure 2 Malignantly transformed ADSCs were positive for some tumor markers

圖3 惡性轉化細胞的超微結構、染色體、裸鼠皮下成瘤和病理Figure 3 The ultrastructure of malignantly transformed ADSCs, chromosomes, tumorigenesis and pathology

2.5 軟瓊脂細胞克隆形成實驗

細胞在軟瓊脂中無克隆形成。

2.6 轉化細胞的染色體為非整倍體

分析100個分離中期細胞（第37代細胞）染色體，所有的這些細胞均為非整倍體，染色體數目波動在65～89之間，眾數為75～79條，眾數染色體占總數的50%，染色體可見雙著絲粒、環狀染色體、易位等結構異常（圖3B）。

2.7 裸鼠皮下成瘤

11只裸鼠在接種細胞后的1個月內，在注射部位都長出了腫瘤，腫瘤逐漸增大，2個月左右直徑可達2 cm以上（圖3C），在腫瘤生長的不同階段，用頸椎脫臼法處死裸鼠，從裸鼠皮下取出腫瘤組織，發現腫瘤與周圍分界基本清楚。腫瘤為單發，實性，包膜較完整，未見小葉，表面有豐富的血管，切面灰白色，質脆，腫瘤直徑小于1 cm時，中心無明顯壞死液化。種植超過3個月的腫瘤中心可見明顯的壞死灶；未見全身重要臟器及局部淋巴結轉移。為鑒定腫瘤的具體性質,對各個腫瘤分別進行了組織學分析。最終的結果表明，11個腫瘤均不同程度地呈現肉瘤的特征，胞核與胞漿比例增大，核染色質細，散在分布，高度分化，可見病理性核分裂（圖3D）。免疫組織化學顯示細胞表達vimentin，為中胚層細胞來源。

3 討論

脂肪來源的干細胞目前也稱為脂肪組織來源的基質細胞，它能分化為脂肪細胞、軟骨細胞、神經細胞、成骨細胞和成肌細胞[5,6,10,11]，因此可用于組織工程的研究和應用。最近有研究證明，骨髓來源的基質細胞在體外長期培養會發生惡性轉化，移植到裸鼠體內能夠形成腫瘤[7]。我們的前期研究證明，ADSCs在化學藥物的誘導下會發生惡性轉化，轉化的細胞在體內能夠形成多種肉瘤組織[9]。

我們對ADSCs進行培養，發現其可在體外發生惡性轉化。到目前為止，惡性轉化細胞系在體外已傳代近8年，傳代100次以上，細胞的形態趨于均一，細胞大小一致，生長的速度相同，表達相同的標志物，因此可以認為細胞來源于1個單細胞克隆。染色體的分析證明，每個細胞的染色體數目是不相同的，這是由于長期培養細胞發生不同的染色體異常的積累所致，使腫瘤細胞異質化，即長期培養的腫瘤細胞個體之間可能有細微的差別。染色體數目波動在65～89之間，75～79條染色體占總數的50%，細胞生長活躍，這些結果提示此細胞系具有惡性腫瘤細胞的特性。國內史春夢等[13]對大鼠的真皮來源的多能干細胞進行培養，也發現了細胞的惡性轉化現象，并且建立了一株惡性轉化細胞系，認為K-ras/mitogen-activated protein kinase（MAPK）激酶信號通路的過度激活在細胞的惡性轉化中發揮重要作用。細胞系在體外不表達p16基因，p16基因失活可能是ADSCs發生惡性轉化的一種關鍵的分子機制[12]。p16基因失活可能由于缺失、突變和啟動子區域的甲基化修飾所致，目前我們的初步研究證實是由于p16基因缺失所致（未顯數據）。ADSCs長期培養過程中染色體的改變或DNA的斷裂，也可能參與細胞惡性轉化的病理過程[14]。

在電鏡下觀察到腫瘤細胞表面有許多微絨毛和突起。研究表明，細胞表面的微絨毛和突起與細胞的粘附能力有關，生長于膠原凝膠表面的細胞，借助這些微絨毛粘附于膠原纖維；并且微絨毛的數量和排列與腫瘤細胞的轉移有關[8]。透射電鏡下見細胞形態不規則，核膜凹陷或突起，核漿比例失調，符合腫瘤細胞的特征。

免疫細胞化學研究證明，細胞表達肌肉細胞的標志物desmin和actin，同時細胞表達中胚層的標志物vimentin。因此可以認為此細胞系來源的是中胚層。細胞系不具有軟瓊脂克隆形成能力，證明細胞的惡性程度較低，這與裸鼠皮下移植的無遠處轉移和病理表現相一致。至今為止，我們應用體外培養技術對ADSCs進行長期培養，建立了惡性轉化的細胞系，通過對該細胞系的形態學、生長動力學及生物學特性的觀察，證實是惡性細胞系，此細胞系可用于肉瘤的基礎研究。

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Adipose tissue-derived stem cells transform malignantly in vitro spontaneously

LIU Guiying1, YANG Liye2,3★, LI Wenyu2, ZHENG Jiakun3, CHEN Hui3, CHEN Qiang2
(1.Department of Stomatology, Chaozhou Central Hospital, Guangdong, Chaozhou 521021, China; 2.Laboratory Medical Center, Chaozhou Central Hospital, Guangdong, Chaozhou 521021, China; 3.Department of Neurosurgery, Chaozhou Central Hospital, Guangdong, Chaozhou 521021, China)

Objective To study adipose tissue-derived stem cells (ADSCs) whether malignant transformation in vitro. Methods ADSCs were isolated and cultured from adipose tissues of mice, which were observed whether to occur malignant transformation. The tissue-specific markers of transformed cells were detected by immunocytochemistry, and the chromosome structure were analyzed. The transformed cells were transplanted into nude mice to investigate their tumorigenicity. Results A flask of ADSCs were successively cultured for 4 months and a number of cells had transformed and immortalized in vitro. The ADSCs were cultured more than 100 generations and still maintained the original cell proliferation rate. The marker of vimentin, PCNA, Ki67 and VEGF-c were expressed but the pan-CK and p16 were not expressed, which showed the cells were mesenchymal origin. Meanwhile, the chromosome analysis showed all cells were aneuploidy and translocation were very common. Microvilli structure of cell surface could be observed by transmission electron microscopy. There was no clone formation ability of transformed ADSCs in soft agar media. Nude mice subcutaneously transplanted could form tumor tissue that the main component was sarcoma. Conclusion Adipose tissuederived stem cells could malignantly transformed spontaneously in vitro, and which also could form tumors in nude mice after transplantation.

Sarcoma; Adipose tissue-derived stem cells; Malignant transformation; Stem cells; Immortalization

國家自然科學基金項目（No.30672359）

1.廣東省潮州市中心醫院口腔科，廣東，潮州521021 2.潮州市中心醫院檢驗醫學中心，廣東，潮州521021 3.潮州市中心醫院神經外科，廣東，潮州521021

★通訊作者：楊立業，E-mail:yangleeyee@sina.com