魔芋葡甘寡聚糖硫酸酯的純化與結構表征

黃皓，楊忠華，王光輝，陳俊，秦曉蓉

（武漢科技大學化學工程與技術學院，湖北武漢 430081）

魔芋是食藥兩用的多年生草本植物，屬天南星科魔芋屬。魔芋葡甘聚糖（KGM）在魔芋塊莖中含量高達55%～80%，KGM 單體的分子中C2、C3、C6均具有較強的反應活性，表現出優良的生物親和性，易制成各種化學衍生物[1]。

由于多糖硫酸酯具有顯著的抗病毒活性，且其活性與相對分子質量大小、硫酸基含量和取代位置及構象密切相關[2]。為更好地拓展魔芋作為功能食品的應用范圍，研究其體外抗病毒活性的可能性，為糖類生化藥物開發奠定基礎，本文報道了經改良的氯磺酸-甲酰胺法制備的聚陰離子產物魔芋葡甘寡聚糖硫酸酯[3]（Hydroxylpropyl Oligo-konjac Glucomannannuroate Sulfate，HOGS）的分離純化及結構表征研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寡聚KGM 醛酸丙酯（HOG）、寡聚KGM 醛酸丙酯硫酸酯（HOGS）：武漢科技大學化工學院生物工程實驗室自制；D-甘露糖、D-葡萄糖（分析純）、葡聚糖凝膠Sephadex G.25、醋酸纖維素薄膜：美國Sigma 公司；甲苯胺藍（分析純）：武漢順天生物技術有限公司；葡聚糖：瑞典Pharmacia 公司。

1.2 儀器設備

傅里葉變換紅外光譜儀（Nexus 型）：美國Thermo Nicolet 公司；超導核磁共振波譜儀（AS 600 型）：美國Varian 公司；凝膠滲透色譜儀（Waters 510 型）：美國Waters 公司。

1.3 方法

1.3.1 離子交換層析分離HOGS

由于HOGS 帶負電荷，采用離子交換法將其與HOG 分離。取適量干燥的717 陰離子樹脂經NaCl 溶液預處理后使用。200 mg 合成的HOGS 粗品溶于10 mL蒸餾水，沿管壁加入。流出液接自動收集器，流出液中加2 滴α-萘酚試劑，沿試管壁加1 mL 濃硫酸，有糖則在液面間形成紫色復合物。去離子水展開直至流出液中無糖為止。

1.3.2 葡聚糖凝膠層析純化HOGS

利用分子篩效應[4]，根據相對分子質量的差異對HOGS 進一步純化。Sephadex G.25 凝膠柱用0.2 mol/L NaCl 溶液平衡、流速為5 mL/h～6 mL/h，上樣（10 mg 樣品溶于1 mL 蒸餾水），保持流速，用0.04 mol/L 吡啶：0.02 mol/L 醋酸（1 ∶1）緩沖液洗脫，BSZ.160 自動部分收集器收集洗脫分離樣品，轉速4.0 r/min，按3 mL 體積分步收集，作洗脫曲線。

1.3.3 醋酸纖維素薄膜電泳鑒定HOGS 純度

取醋酸纖維素薄膜（2×8 cm）放在pH 12.5 的0.025 mol/L 硼酸鹽緩沖液中浸泡15 min～20 min，取膜條，夾在兩層濾紙內吸去多余的緩沖液。另切1 mm～5 mm 薄膜浸漬樣品溶液約1 μL（10 μg），緊貼離膜條一端2 cm 處，使膜條點上細條狀的多糖樣品。按常規電泳方法，經過電泳、染色、漂洗至無糖區染色劑的底色完全脫去為止。

1.3.4 凝膠滲透色譜（GPC）測定HOGS 相對分子質量

凝膠滲透色譜法測定HOGS 的重均相對分子質量（Mw）、數均相對分子質量（Mn）和多分散系數（Mw/Mn）。采用TSKG-3000SW 凝膠過濾柱（300 mm×7.5 mm），在Waters 510 型HPLC 儀上進行分離，檢測器為410 型示差檢測器，并以葡聚糖為標準品進行測定[5]。色譜條件為：柱溫，210 ℃（自動柱溫控制系統）；柱壓，5MPa（600 型恒壓泵）；進樣器50μL；進樣量20μL；流動相：HAc-NaAc 緩沖液（pH5）；流速，1.0 mL/min；洗脫時間，60 min。數據處理采用Astra 軟件。

1.3.5 傅里葉紅外光譜（FT-IR）分析

取凍干后的HOG 和HOGS 輾細，采用Nexus 傅里葉紅外光譜儀進行紅外光譜測定，選用歐米采樣器直接測定。波數范圍：4 000 cm-1至400 cm-1；分辨率：0.09 cm-1；掃描次數：32/64[6]。

1.3.6 氫核磁共振波譜（1H-NMR）分析

取凍干后的HOG 和HOGS 各0.5 mg 分別溶于1 mL D2O，以D2O 為內標，定為4.8 ppm，在599.78 MHz 的磁場中，譜線寬度為6 631.8 Hz，操作溫度為298 K，HOD信號在前3S 預飽和進行抑制，記錄質子去偶的1HNMR[7]。

2 結果與分析

2.1 HOGS 與HOG 的分離

離子交換層析的樣品洗脫液用硫酸-蒽酮法檢測糖含量，離子交換洗脫曲線見圖1。

圖1 HOGS 離子交換層析洗脫曲線Fig.1 Ion exchange chromatography analysis of HOGS

由圖1 可以看出，在較低濃度0.4 mol/L NaCl 溶液的洗脫下，0～15 管收集液的糖含量為零，未有糖峰出現，表明HOGS 完全被陰離子樹脂吸附，可見本試驗中HOG 樣品經硫酸化后引入了負電荷的硫酸基團。在0.4、0.8 mol/L 和1.6 mol/L NaCl 的梯度洗脫下，隨著NaCl 濃度的增加，HOGS 與陰離子樹脂的吸附被Cl-競爭取代，與樹脂分離，被洗脫下來，在24 管時糖含量達到最大，洗脫曲線出現的糖峰為單一峰，表明HOGS 組分均一。

2.2 HOGS 葡聚糖凝膠層析純化結果

經乙醇沉淀、離子交換、透析、冷凍干燥后的HOGS 溶于水，用Sephadex G-25 凝膠層析柱進一步純化，以收集管號為橫坐標，糖濃度為縱坐標，作凝膠層析洗脫曲線如圖2。

圖2 HOGS 凝膠過濾Sephadex G-25 柱層析圖Fig.2 Sephadex G-25 gel filtration analysis of HOGS

由圖2 可知，在洗脫的初始階段，1～10 管收集液基本上沒有HOGS 成分，糖含量極少。隨著洗脫的繼續進行，從11 管開始，吸光度逐漸增加，表明糖含量逐漸增加，在12～13 管時達到最大，此后又逐漸下降。

多糖分子的大小和形狀不同，在層析柱中的移動速度也不同，從分部收集中出現的峰的多少和形狀，判斷該多糖的純度，因此，根據洗脫曲線出現的糖峰為單一對稱峰，可以判斷HOGS 為分子大小和形狀均一的組分。

2.3 醋酸纖維素薄膜電泳鑒定純度結果

圖3 醋酸纖維素薄膜電泳圖Fig.3 The acetyl cellulose thin film electrophoresis

采用以pH12.5 的硼酸鹽緩沖液為電泳介質，在250 V 電壓下電泳20 min。電泳的結果如圖3，可以看出醋酸纖維素薄膜上面顯示單一藍色的條帶，表明所得的糖的組分比較均一。

2.4 HOGS 相對分子質量分布

HOGS 相對分子質量采用凝膠色譜法測定，如圖4 所示。

圖4 HOGS 凝膠滲透色譜圖Fig.4 GPC spectra of HOGS

結果表明，示差檢測器得到的凝膠滲透色譜圖呈正態分布，多分散系數Mw/Mn=1.01，HOGS 的相對分子質量峰值Mp 為1 608 D，重均相對分子質量Mw 為1 595 D，數均相對分子質量Mn 為1 572 D。相對分子質量分布寬度指數σn 計算公式：σ2n=Mn（2Mw/Mn-1）=3.62×104。

HOGS 純品為相對分子質量分布窄的硫酸多糖。

2.5 HOGS 硫酸基團表征

KGM、HOG、HOGS 紅外光譜分析如圖5 所示。

圖5 KGM（a）、HOG（b）和HOGS（c）紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectra of KGM（a）、HOG（b）and HOGS（c）

2.6 HOGS 引入硫酸基團位置表征

圖6 HOG 的1H-NMR 譜圖Fig.6 1H-NMR spectra of HOG

圖7 HOGS 的1H-NMR 譜圖Fig.7 1H-NMR spectra of HOGS

引入硫酸基團的碳，化學位移將移向低場約8 ppm，由譜圖6 和譜圖7 對比可以看出，糖環質子堆積的區域峰型發生了變化，部分質子信號移向低場，說明強電負性的硫酸基團的引入，對糖環質子信號產生影響，導致吸電子誘導效應的增加，相應的質子化學位移值越大，表明在糖環的C2和C3位的羥基上接有硫酸基團。同時，δ=1.10 ppm 處質子吸收峰的積分面積與糖環上質子信號堆積區域吸收峰面積之比在硫酸化前后發生顯著變化，硫酸酯化前約為1 ∶9，硫酸化后約為1 ∶35，表明C6位連接的羥丙基的甲基氫的信號明顯減弱，說明甲基氫的化學位移發生改變，可能受酯化反應的影響，在C6位連接的羥丙基上的羥基也發生了硫酸酯化反應，接有硫酸基團。

3 討論

多糖混合物純化的方法很多，有鹽析法、金屬絡合法、親和色譜法、高效毛細管電泳法、制備性區域電泳法等。低聚糖的純度標準不能用普通的小分子化合物的純度標準來衡量，因為即使是純品的低聚糖也存在微觀不均一的問題，其純度只代表某一類糖相似鏈長的均一組分。HOGS 的純度直接影響其作為功能食品的抗病毒活性，在后續的研究中，HOGS 的純度與收率是純化工藝的關鍵。

結構表征結果表明，HOGS 為相對分子質量分布很窄的低相對分子質量硫酸多糖，其易為機體吸收的特點能夠更好地發揮抗病毒活性。FT-IR 顯示分子已連上硫酸基。核磁共振波譜分析表明，硫酸基團的連接位置可能在葡萄糖和甘露糖C2、C3和C6位上，符合硫酸多糖抗病毒活性與硫酸基團連接位置的構效關系規律。

鑒于硫酸聚陰離子含量即硫酸基取代度也是抗病毒活性的關鍵因素；同時，組成多糖的單糖連接形式對多糖的構象也會產生影響，從而引起抗病毒活性的改變。因此，后續結構表征可運用X-射線衍射光電子能譜對HOGS 進行表面S 元素定量分析，并結合高碘酸氧化法分析HOGS 的單糖連接形式，從而進一步闡明HOGS 抗病毒的構效關系。

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