微囊藻毒素-LR對SD大鼠的短期毒效應研究

李秀娣，毛光明

（1.杭州市標準化研究院，浙江杭州 310005；2.浙江省疾病控制中心，浙江杭州 310051）

微囊藻毒素（microcystin，MC）是一類主要由藍藻產生的一類環狀七肽的肝毒素[1]，其毒性作用的靶器官為肝臟，可導致肝細胞損傷，并提高肝癌的發病率[2]，近年來有研究表明，該毒素亦可特異性分布于腎臟，并可能產生腎毒性[3]。微囊藻毒素-LR（MC-LR）是最為常見的一類。微囊藻毒素廣泛分布于我國淡水水系中，水體中MC-LR 總含量通常在0.1 μg/L～1 μg/L，水華大量腐敗消解時，最大可在80 μg/L～90 μg/L 左右[4]。該毒素可以通過淡水水生生物富集進入食物鏈，間接危害人類健康[5]。同時，該毒素亦可污染飲用水源[6-7]。由于該毒素結構穩定，能抵抗pH 變化和高溫，且不易被沉淀和吸附[8-9]，因此，飲用水中去除MC-LR是非常困難的。目前尚未有實驗室條件下關于短期直接飲用含不同劑量MC-LR 的飲用水導致實驗動物肝臟和腎臟損傷的研究。

本實驗通過對SD 大鼠的飲用的蒸餾水中添加低毒和高毒劑量的純MC-LR，觀察不同劑量的MC-LR對臟器系數、肝腎功能和氧化應激相關指標的影響，探索MC-LR 污染飲用水后，對機體損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

200 g 左右的SD 大鼠：浙江省實驗動物中心。

微囊藻毒素（MC-LR）：美國Sigma 公司；丙二醛（MDA）測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、過氧化氫酶（CAT）測試盒：上海工碩生物技術有限公司。

7600 全自動生化分析儀：日本Hitachi 公司；UV754 型紫外可見光分光光度計：上海光譜儀器有限公司；LG10-2.4A 型離心機：北京醫用離心機廠；D-37520 低溫高速離心機：Thermo，德國。

1.2 方法

1.2.1 飲用水中MC-LR 對大鼠毒性模型的建立

飲用水中MC-LR 對大鼠毒性的實驗模型，如表1所示。

表1 飲用水中MC-LR 對大鼠毒性的實驗模型Table 1 The SD rat model for toxicity effect testing of MC-LR

選用SD 大鼠54 只，按表1 隨機分為9 組，每組6 只。將MC-LR 溶于大鼠的日常飲用的蒸餾水中至質量濃度為8 μg/L（低毒組）和80 μg/L（高度組）；對照組不加MC-LR，用以喂養大鼠2 周。在實驗期間，動物自由進食進水，室溫保持在（20±1）℃，濕度為（45±10）%，并保持12 h 的晝夜循環。

1.2.2 樣品采集

各組分別在給藥后的1、7 和14 d 處死前稱重。

開腹，腹主動脈取血法采血，部分取全血置于肝素處理的離心管中，其余置于普通離心管中析出血清；指標檢測前，所有血液樣本均3 000 r/min 離心，取上清測定。取血完畢后立即處死大鼠，分離出肝、腎，用于后續測定。

1.2.3 臟器系數的測定

分離出肝、腎后，立即于分析天平上稱質量，計算大鼠肝臟和腎臟系數。

1.2.4 肝腎功能的測定

運用全自動生化分析儀采用酶促反應速率法檢測丙氨酸氨基轉移酶（ALT），天冬氨酸氨基轉移酶（AST），堿性磷酸酶（ALP），肌酐（Cr），尿素氮（BUN）。

1.2.5 氧化應激相關指標的測定

采用試劑盒方法測定血清SOD，CAT 活性和MDA含量。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 大鼠體重增長情況

口服MC-LR 對大鼠體重增長情況的影響，見表2。

表2 口服MC-LR 對大鼠體重增長情況的影響（n=6）Table 2 The effects of MC-LR on the weights of SD rats（n=6）

實驗期間未出現動物意外死亡。如表2 所示，飼養后第1 天，三組體重差異沒有統計學意義（P＞0.05）。飼養后第7 天和第14 天，低毒組動物體重與對照組比較，無差異（P＞0.05）。但高毒組動物體重與對照組和低毒組比較，體重增長明顯減緩，差異有極顯著統計學意義（P＜0.01）。

2.2 口服MC-LR 對臟器系數的影響

口服MC-LR 對大鼠臟器系數的影響，見表3。

根據表3 可知，飼養后第1 天，3 組肝臟系數和腎臟系數之間，差異沒有統計學意義（P＞0.05）。低毒組飼養后第7 天和第14 天，肝臟系數和腎臟系數與對照組相比，差異沒有統計學意義（P＞0.05）。高毒組飼養后第7 天和第14 天后，肝臟系數和腎臟系數較對照組和低毒組極顯著增加（P＜0.01）。

表3 口服MC-LR 對大鼠臟器系數的影響（n=6）Table 3 The effects of MC-LR on the organ function of SD rats（n=6）

2.3 口服MC-LR 對肝臟酶學指標ALT、AST 和ALP的影響

口服MC-LR 對肝臟酶學指標的影響，見表4。由表4 可知，對照組飲用蒸餾水，各時間點之間肝功能指標無顯著改變（P＞0.05）。飼養后第1 天，三組的肝臟酶學指標，差異沒有統計學意義（P＞0.05）。飼養后第7 天和第14 天后，低毒組各項指標，較對照組均有所升高，但差異沒有統計學意義（P＞0.05）。高毒組的ALT，AST 和ALP 指標出現極顯著增加（P＜0.01），并且隨著時間的推移，高毒組各項指標呈極顯著增加趨勢（P＜0.01）。

表4 口服MC-LR 對肝臟酶學指標的影響（n=6）Table 4 The effects of MC-LR on the liver function of SD rats（n=6）

2.4 口服MC-LR 對腎臟酶學指標CR 和BUN 的影響

口服MC-LR 對腎臟酶學指標的影響，見表5。

表5 口服MC-LR 對腎臟酶學指標的影響（n=6）Table 5 The effects of MC-LR on the kidney function of SD rats（n=6）

根據表5 的統計學結果，對照組飲用蒸餾水，各時間點之間腎臟酶學指標無顯著改變（P＞0.05）。飼養后第1 天，三組的腎臟酶學指標，差異沒有統計學意義（P＞0.05）。飼養后第7 天和第14 天，低毒組各項指標，較對照組均有所升高，但差異沒有統計學意義（P＞0.05）。高毒組的與對照組和低毒組相比，CR 和BUN極顯著增加（P＜0.01），且隨著時間的推移，高毒組各項指標明顯升高（P＜0.05）。

2.5 口服MC-LR 對大鼠血清抗氧化活性的影響

口服MC-LR 對氧化應激相關指標的影響，見表6。

表6 口服MC-LR 對氧化應激相關指標的影響（n=6）Table 6 The effects of MC-LR on the oxidative stress of SD rats（n=6）

如表6 所示，對照組飲用蒸餾水，各時間點之間血清中過氧化氫酶（CAT），超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量基本沒有變化（P＞0.05）。低毒組的CAT，SOD 在飼養后第1 天，7 天和14 天較對照組出現極顯著升高；高毒組的CAT，SOD 在飼養后第1 天和第7 天較對照組出現極顯著升高；氧化應激代謝產物，丙二酸（MDA）低毒組在飼養后第7 天出現顯著增加（P＜0.05），低毒組在飼養第14 天，高毒組在飼養后第7 天和第14 天出現極顯著增加（P＜0.01）。

隨著時間變化，低毒組CAT 值在飼養第7 天較第1 天顯著升高（P＜0.05），但第14 天變化不大。高毒組CAT 值在飼養第7 天較第1 天極顯著升高（P＜0.01），但第14 天較第1 天和第7 天都出現極顯著降低（P＜0.01）。低毒組SOD 值飼養后的各時間點未出現顯著改變（P＞0.05）。高毒組SOD 值在飼養第7 天較第1 天極顯著升高（P＜0.01），但在飼養第14 天較第1 天和第7 天極顯著降低（P＜0.01）。高毒組和低毒組MDA 值在飼養后的各時間點都呈極顯著升高趨勢（P＜0.01）。

3 討論

本實驗采用蒸餾水添加MC-LR 的方法對大鼠進行飼喂，研究SD 大鼠在短期持續性暴露MC-LR 后機體損傷的情況和損傷機制。經過7 天和14 天的暴露后，低毒組生長狀況良好，肝腎系數未出現顯著改變。說明低濃度MC-LR 的短期持續暴露對肝腎影響較小，不引起肝臟和腎臟的質量增加。高毒組大鼠的體重增加出現明顯抑制，并且肝腎系數出現了顯著增加，說明對高濃度MC-LR 的短期持續性暴露會導致肝臟和腎臟發生了出血和腫脹等反應[10-11]，引起肝腎質量增加，解毒功能失代償，進而影響到大鼠攝食和體重增加。

通過對實驗動物肝腎功能的監測，低毒組的肝功能酶學指標ALT，AST 和ALP 以及腎功能指標CR 和BUN 在觀測期間均未出現顯著異常，說明大鼠的肝臟和腎臟在對MC-LR 的低濃度短期持續暴露的損傷是可修復或者可代償的，因此未導致功能性的損傷。然而當對MC-LR 進行高濃度短期持續暴露，就會導致肝腎功能嚴重受損。高毒組出現肝功能酶學指標和腎功能指標極顯著增加，表現出功能性的失代償。且這種損傷是難以修復的，表現為隨著時間的推移，肝腎功能指標進行性的增加。這一表現說明了短期高濃度持續暴露MC-LR 之后，肝腎功能的損傷會加重和不可逆。短期高濃度持續暴露之后，MC-LR 存在蓄積效應，可以推測，當低濃度長期暴露的話，蓄積到一定的劑量，會引起類似的損傷。也說明實驗動物對大劑量的MC-LR 的接觸缺乏良好的解毒機制。

CAT、SOD 是生命體在自我保護過程中兩種非常重要的生物活性物質，多存在于過氧化物酶體內；是機體消除在新陳代謝和損傷修復過程中產生的氧自由基，對抗和阻斷氧自由基對細胞造成損傷的重要的抗氧化劑[12]。當這兩種物質的活性受到抑制，就會出現氧化應激產物MDA 生成的增加。因此，CAT 和SOD 活性可間接反應機體清除自由基的能力。而MDA 是氧自由基攻擊細胞膜中不飽和脂肪酸后形成的脂質過氧化物，MDA 的水平可以間接反映細胞膜損傷的程度[13-14]。

本實驗表明，當短期低濃度接觸MC-LR 之后，機體的CAT 和SOD 活性都出現顯著性的升高，隨著時間的推移，CAT 先增加而維持不增，而SOD 保持相對穩定的水平，說明CAT 比SOD 的敏感性高。在接觸初期，MDA 水平保持不增，但隨著時間的推移，MDA 出現極顯著性增加。說明在短期低濃度持續性接觸MCLR 后，機體自身的抗氧化系統不足以對抗MC-LR 對細胞的損傷，盡管肝腎功能未出現顯著性異常，但細胞的損傷還是存在的。可以推測繼續長期接觸的話，將會導致肝細胞的反復損傷，進而可能導致肝腎功能的失代償，甚至肝癌的發生，研究也表明，在肝癌高發地區的水源中可檢出高含量的微囊藻毒素[15-17]。

當短期高濃度持續接觸MC-LR 之后，機體的CAT和SOD 活性先出現極顯著升高，接著出現抑制，這種抑制的程度，極顯著的低于正常活性范圍。同時，MDA 水平出現極顯著的增加，并同時伴有肝腎功能的嚴重受損。持續暴露于高濃度的MC-LR 環境，會導致機體的抗氧化系統受到抑制，從而出現了機體的失代償。

本實驗得出的結果表明，短期持續低濃度接觸MC-LR 對機體的抗氧化系統影響較小，機體可以在一定程度上代償并恢復肝腎細胞的損傷，因此肝腎功能可不出現的異常。但短期持續高濃度接觸MC-LR 之后，機體的抗氧化系統將受到抑制，機體無法代償并出現嚴重的肝腎功能損傷，MC-LR 對機體的毒性存在蓄積效應，生物體若長期持續暴露于MC-LR，將引起機體肝腎功能的失代償。因此有必要加強對飲用水中MC-LR 的監測和清除工作。

[1]Bourne D G,Jones G J,Blakeley R L,et al.Enzymatic pathway for the bacterial degradation of the cyanobaeterial cyclic peptide toxin microcystin LR[J].Applied and environmental microbiology,1996,66(11)：4086-4094

[2]陳華,孫昌盛,胡志堅,等.飲水微囊藻毒素污染促肝癌作用實驗研究[J].腫瘤防治雜志2002,9(5)：454-456

[3]張占英,俞順章,衛國榮,等.微囊藻毒素LR 在動物體內整體水平及細胞水平的分布[J].衛生毒理學雜志,2002,16(1)：5-8

[4]Chorus I,Bartram J.Toxic cyanobacteria in water：a guide to their public health consequences,monitoring and management[M].London：spons architecture price book,1999：416

[5]李效宇,王瑩,李真愛.口服微囊藻對泥鰍的亞慢性毒性效應[J].河南師范大學學報：自然科學版,2008,36(1)：92-95

[6]董傳輝,俞順章,陳剛,等.江蘇幾個地區與某湖周圍水廠不同類型水微囊藻毒素調查[J].環境與健康雜志,1998,15(3)：111-113

[7]孟玉珍,張丁,王興國,等.鄭州市水源水藻類和藻類毒素污染調查[J].衛生研究,1999,28(2)：100-101

[8]Ireneusz M,Paulina S,Tarcynska,et al.Toxicity of microcystin from cyanobacteria growing in a source of drinking water[J].Comparative biochemistry and physiology,2004,139(3)：175-179

[9]樊有斌,詹壽發,甘金蓮,等.微囊藻毒素的危害及防治[J].生命化學,2008,18(1)：101-103

[10]Miura G A,Robinson N A,Lawrence W B,et al.Hepatotoxicity of microcystin-LR in fed and fasted rats[J].Toxicon,1991,29(3)：337-346

[11]Falconer I R,Stephen J H,Andrw R H,et al.Hepatic and renal toxicity of the blue green alga (cyanobacterium)cylindrospermopsis raciborskii in male Swiss Albino mice[J].Environ Toxicol,1999,14(1)：143-150

[12]Goette A,Bukowska A,Lendeckel U,et al.Angiotensin Ⅱreceptor blockade reduces tachycardia-induced atrial adhesion molecule expression[J].Circulation,2008,117(6)：732-42

[13]黃儒強,李娘輝,黃科禮,等.山稔子黃酮類提取物抗自由基作用及體內抗氧化功能的研究[J].食品科學,2008,29(9)：588-590

[14]王績群,趙學忠,蓋春宇,等.卡維地洛對正常大鼠氧化應激的影響[J].中國老年學雜志,2012,32(6)：1207-1208

[15]孫昌盛,陳華,薛常鎬,等.同安水環境藻類及藻類毒素分布調查[J].中國公共衛生,2000,16(2)：147-148

[16]陳剛,俞順章,衛國榮,等.肝癌高發區不同飲用水類型中微囊藻毒素含量調查[J].中華預防醫學雜志,1996,30(1)：6-9

[17]張明東,俞順章,梁任詳,等.廣西扶綏縣原發性肝癌病例對照研究[J].中華流行病學雜志,1993,14(1)：14-17