木瓜蛋白酶水解胡子鯰的研究

周燕芳

（韓山師范學院化學系，廣東潮州 521041）

胡子鯰，俗稱塘鲺，在分類上屬鯉形目、胡子鯰科，屬于熱帶、亞熱帶魚類，廣布于我國南方各地，既是營養豐富的消費品，同時具有較好的藥用及滋補作用[1]。胡子鯰適應能力強，容易養殖，成本較低，是重要淡水魚類養殖對象。一般只作為人們餐桌的食用魚類之一，本試驗根據胡子鯰魚類的易養殖、產量大的特點，結合多肽、氨基酸等具有生物活性物質（如對鳙魚[2]、鰻魚[3]、雞肉[4]等的研究）的開發前景，對胡子鯰魚蛋白酶水解條件進行研究，通過對木瓜蛋白酶水解胡子鯰的水解條件的研究，目的是找出最佳的水解途徑，以便為胡子鯰功能食品開發和利用做一些探索性研究。

1 實驗部分

1.1 試驗材料及主要儀器、設備

1.1.1 試驗材料與試劑

胡子鯰：購于潮州市橋東市場；

木瓜蛋白酶（酶活力6 000 U/mg），其它試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器與設備

501 超級恒溫槽：上海恒平科學儀器有限公司；800 型離心機：上海手術器械廠；FA2004N 電子天平：上海精科；數顯精密pH 計；微量凱氏定氮儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程[5]

新鮮胡子鯰→蒸熟、壓榨（去脂肪）→65 ℃烘干、搗碎的魚粉（備用）→稱量→加水稀釋→調pH→加溫酶水解→滅酶（100 ℃，10 min）→冷卻→離心（15 min）→收集上清液，定容至50 mL→分析

1.2.2 測定方法

1.2.2.1 氨基態氮含量的測定

采用雙指示劑甲醛滴定法[6]。

取兩個干凈的三角瓶，各吸取10 mL 酶水解液，第一個瓶中加入5 mL 甲醛和3 滴酚酞，搖勻、靜置1 min后，用0.01 mol/L NaOH 標準液滴定，消耗體積為V1；第二個瓶中加入3 滴中性紅指示劑，搖勻、靜置1 min后，用0.01 mol/L NaOH 標準液滴定，消耗體積為V2。按下式計算胡子鯰酶水解液中氨基態氮含量：氨基態氮含量/（mg/L）=c×（V1-V2）×10×0.014×1000/0.01L，式中：c 為NaOH 標準液濃度，（mol/L）。

1.2.2.2 原料總氮量的測定

微量凱氏定氮法[7]。

1.2.2.3 水解度的測定

水解液中游離氨基態氮含量/原料總氮含量×100%[8]。

1.2.3 試驗設計[9]

酶用量、底物濃度、酶水解溫度、酶水解時間和pH均對木瓜蛋白酶對胡子鯰魚蛋白的水解有影響。本試驗采用單因素試驗（即在其它因素不變的情況下研究某一因素對酶水解效果的影響），確定各因素的最佳條件，再采用L9（34）[10]正交表進行正交試驗，以氨基態氮含量為指標，確定木瓜蛋白酶的最佳酶水解條件。

1.2.4 酶水解液的制備

稱取一定量搗碎的魚粉，按比例加入蒸餾水，預熱至設定溫度，調pH 至規定值，加酶恒溫水解一定時間后移至沸水浴中，進行滅酶活10 min，離心取上清液即為水解液，定容至100 mL。取酶水解液進行測定。

2 實驗過程與結果分析

2.1 單因素的研究

2.1.1 酶用量對酶水解效果的影響

酶用量對水解度的影響在胡子鯰水解的過程中，木瓜蛋白酶的用量是影響水解程度的一個因素，在底物濃度為2.5%、溫度為50 ℃，水解時間4 h、pH 為7.0的條件下，分別配制酶濃度為0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%的胡子鯰漿液，以水解度為考察指標，結果見圖1。

圖1 酶濃度對水解效果的影響Fig.1 Effect of density of protease on hydrolyzation

由圖1 的結果可看出，隨著酶用量的增加胡子鯰蛋白的水解度逐漸增加，但木瓜蛋白酶的濃度達到一定程度后，水解度隨著加酶量的變化趨勢有所緩慢。因此，木瓜蛋白酶水解胡子鯰的最佳酶濃度為1.6%左右。

2.1.2 底物濃度對水解效果的影響

分別配制底物濃度為2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%的胡子鯰漿液，調節其pH 為7.0，酶濃度為1.6%，50 ℃下水解4 h 后測定其水解度，找出最佳的底物濃度，見圖2。

圖2 底物濃度對水解效果的影響Fig.2 Effect of density of substretum on hydrolyzation

由圖2 可見，底物濃度在3.5%左右胡子鯰水解度相對較高。隨著底物濃度的增加，胡子鯰的水解度有所下降這主要是由于底物濃度過高，體系的有效水濃度降低這就降低了底物與酶的接觸幾率。因此，胡子鯰水解的最佳底物濃度為3.5%左右。

2.1.3 酶水解時間對酶水解效果的影響

在試驗中選取底物濃度為3.5%，酶濃度為1.6%，pH 為7.0，溫度為50 ℃下對胡子鯰蛋白進行酶水解，研究酶水解時間對水解度的影響，結果見圖3。

圖3 酶水解時間對水解效果的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on hydrolyzation

由圖3 可見，在最初5 h 內水解度隨酶水解時間的增加而迅速提高，當達到一定時間（5 h）后，水解度的增加變得緩慢，基本上趨于不變。因此認4 h～5 h 為木瓜蛋白酶酶水解胡子鯰蛋白的最佳時間。

2.1.4 酶水解溫度對酶水解效果的影響

選定底物濃度為3.5 %，酶濃度為1.6 %，pH 為7.0，分別在40、45、50、55、60、65 ℃下水解5 h，通過水解度的具體數值確定最佳溫度，見圖4。

由圖4 可見，在溫度為40 ℃～50 ℃范圍內水解度隨著溫度的提高而增大，當溫度再增加時水解度反而有所下降。這主要是由于溫度對木瓜蛋白酶的影響，溫度太高會使酶滅活，而溫度過低則酶的活性不足，兩者會導致水解度的降低，因此最佳的酶水解溫度為50 ℃左右，這時酶的活性最高。

圖4 酶水解溫度對水解效果的影響Fig.4 Effect of temperature on hydrolyzation

2.1.5 體系初始pH 對酶水解效果的影響

選取底物濃度為3.5%，酶濃度為1.6%，溫度為50 ℃，在不同pH 條件下水解5 h，確定最佳酶水解pH，見圖5。

圖5 pH 對水解效果的影響Fig.5 Effect of pH on hydrolyzation

由圖5 可看出體系初始pH 對水解度有一定的影響，當pH 在6～7.5 范圍內，水解度隨著pH 的增加而提高，當pH 大于7.5 時水解度隨著pH 的增加反而有所下降。這就說明采用木瓜蛋白酶水解胡子鯰時，酶水解液的最適pH 為7.0～7.5 之間。因此，本試驗體系的起始pH 固定在7.0。

2.2 胡子鯰最佳酶水解工藝條件的確定

根據以上單因素試驗，確定了酶用量、底物濃度、酶水解時間、體系起始pH 以及酶水解溫度。其中體系的起始pH 采用固定值7.0，綜合考慮酶水解過程是同時受各因素的影響，故采用三水平四因素即L9（34）進行正交試驗，確定酶水解的最佳工藝條件。各因素及相應水平見表1。

從表1 可知，在這幾個因素中，酶濃度對水解效果的影響最為顯著，各因素對胡子鯰魚蛋白酶水解效果影響的大小順序是：酶濃度＞底物濃度＞酶水解溫度＞酶水解時間。胡子鯰魚蛋白的最佳酶水解條件為A3B1C3D3，因為該條件沒有出現在正交表里，所以進行驗證實驗，即在酶水解溫度為55 ℃的條件下，底物濃度為3.5%，，酶濃度為1.8%，酶水解6 h 后胡子鯰蛋白獲得最大水解度為30.65 %。所得結果水解度30.65 %＞29.00%（正交表里的最大值），所以該正交試驗結果可靠。

表1 木瓜蛋白酶酶水解胡子鯰蛋白L9（34）正交試驗設計及結果分析Table 1 Design of L9（34）orthogonal test and experimental result of hydrolysis of Clarias fuscus by papain

3 結論與討論

實驗得出以水解度為考察指標，采用木瓜蛋白酶對胡子鯰魚蛋白進行水解，水解效果較好。通過對單因素的考察結合正交實驗確定木瓜蛋白酶水解胡子鯰魚蛋白的最佳條件是pH7.0，酶濃度為1.8%，底物濃度為3.5%，在溫度為55 ℃，酶水解6 h。在此條件下胡子鯰的水解效果最好，水解度可達到30.65%。

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