液質聯用測定潮汕豬肉丸中的β-受體激動劑

謝鴻，李婷，楊澤川

（廣東省食品質量監督檢驗站（潮州），廣東潮州 521011）

克倫特羅和萊克多巴胺都屬于苯乙醇胺類，克倫特羅屬于苯胺型，萊克多巴胺屬于苯酚型[1]。它們都是屬于β-激動劑，俗稱“瘦肉精”，將瘦肉精添加于飼料中，可導致動物體內脂肪代謝增強，蛋白質合成增加[2]，降低酮體脂肪含量，起到改變酮體瘦肉和脂肪比例的作用[3]。但是瘦肉精在動物臟器中殘留，通過食物鏈進入人體，人體攝入量達到一定值或食用了高殘留的內臟組織，易出現毒副作用[4]。我國將其列入禁用藥品目錄[5]。而有少數飼養場仍非法使用，嚴重威脅著消費者的健康[6]。動物源性食品中違禁藥物的殘留已成了困擾世界范圍內食品衛生的難題，因此，研究快速測定鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺殘留量的檢測方法具有十分廣泛的意義。根據潮汕地區的飲食特點，選用地方特色食品潮汕肉丸中較易有瘦肉精殘留的豬肉丸為代表，采用固相萃取-液質聯用法對鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺的殘留檢測方法進行研究。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、材料

1.1.1 儀器

安捷倫1200 Series/ 6410 Triple Quad LC/MS；EL-320S 電子天平：常州天之平儀器設備有限公司；T25 basic 勻漿機：德國IKAT；XW-80A 旋渦混合器：上海醫科大學儀器廠；SHA-C 水浴恒溫震蕩器：金壇市開發區吉特實驗儀器廠；9690A 型超聲儀：天津科貝爾光電技術有限公司；恒溫水浴鍋：廣東環凱微生物科技有限公司；TGW16 臺式微量高速離心機：長沙英泰儀器有限公司；固相萃取裝置：艾貝爾科技有限公司；AP-01P 真空泵：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；HGC-12A 氮吹儀。

1.1.2 材料

市售的潮汕豬肉丸；Poly-Sery MCX 固相萃取柱（60 mg，3 mL）；乙酸銨（分析純）；氨水（分析純，含量：25 %～28 %）、甲醇（色譜純）；甲酸（分析純，含量≥88.0 %）、鹽酸（分析純）、乙酸（分析純）、β-葡萄糖醛苷酸酶（100 400 units/mL）、鹽酸克倫特羅標準物質（純度：98.5%）、萊克多巴胺標準物質（純度：95.5%）。

1.2 溶液配制

1.2.1 標準儲備液

準確稱取鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺標準品各0.050 0 g，分別用80%甲醇水溶解并定容至50 mL，此溶液濃度為1 mg/mL，于4 ℃冰箱中保存，有效期3 個月。實驗用水為GB/T 6682-2008《分析實驗室用水規格和試驗方法》規定的一級水[7]。

1.2.2 標準工作液

快遞企業在定價時，要遵循既能彌補快遞服務的成本（4Cs中的成本策略，彌補企業成本），又要考慮消費者的承受能力（4Cs中的成本策略，確定消費者能付出的成本），又能獲取企業最大的利潤（4Rs中的回報策略）的定價的指導思想。例如，消費者需要快遞企業在極短時間內將快遞送到指定地點，快遞企業在觀察到競爭者并不擁有同類產品的情況下，可決定在消費者認可的情況下采用撇脂定價策略，即先制定較高的定價，獲取企業的最大利潤，打響價值戰，打造優質品牌，直到其他快遞企業也開始提供類似快遞服務時才將價格降到正常水平。

根據需要，將標準儲備液配制成適當濃度的標準工作液，標準工作液在使用前配制[7]。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為安捷倫ZORBAXExlipsePlusC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；進樣量：2.5 μL；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；流動相為A-0.1%甲酸水+10 mmol/L 乙酸銨，B-甲醇，梯度洗脫，洗脫的時間和比例見表1。

1.3.2 質譜條件

干燥氣為氮氣，流速10 L/min，溫度350 ℃；霧化氣：氮氣，38 psi；電噴霧電離正離子模式ES（I+）；離子噴霧電壓4 000 V；質譜掃描方式：多反應離子監測（MRM）。

表1 時間和比例Table 1 Time and proportion

1.4 樣品處理

1.4.1 提取

稱取均勻的樣品5.00 g（準確至0.01 g），加30 mL 20 mmol/L 乙酸銨緩沖溶液（pH5.2）勻漿1 min，轉移至50 mL 具塞比色管中，加入β-葡萄糖醛苷酸酶溶液100 μL，于（37±1）℃振蕩酶解過夜，取出后超聲振蕩15 min，再置于80 ℃水浴中加熱30 min，取出冷卻后定容到50 mL，放入高速離心機中10 000 r/min 離心10 min，取上清液待過MCX 固相萃取柱。

1.4.2 凈化

MCX 柱，使用前用5 mL 甲醇、5 mL 蒸餾水、5 mL 30 mmol/L 鹽酸溶液活化。取1.4.1 制得的上清液3 mL過柱，棄去濾液，依次用5 mL 水，5 mL 甲醇淋洗，最后用5 mL 5 %甲醇氨洗脫，整個過程流速控制不超過1 mL/min，洗脫液50 ℃下氮氣吹干后，用初始流動相定容至3 mL，用于LC/MS 測定。

2 定性與定量

采用質譜檢測器對兩種化合物的質量色譜峰的保留時間和特征離子定性、確證，并用外標峰面積法定量。鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺殘留量計算公式為：

式中：X 為樣品中鹽酸克倫特羅或萊克多巴胺含量，（μg/kg）；C 為試液中鹽酸克倫特羅或萊克多巴胺的濃度，（ng/mL）；V 為試液定容體積，mL；m 為試樣質量，g。

3 結果

3.1 工作曲線

按選定的儀器條件對已配制的鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺標準系列溶液進行測量，以組分的質量濃度為橫坐標，組分的色譜峰面積為縱坐標，繪制校準曲線，校準曲線的回歸方程及相關系數如表2 所示，校準曲線見圖1 和圖2。

3.2 分析方法的準確度（回收率試驗）及精密度

于不同市場購得潮汕豬肉丸4 份，每個樣品分別稱取約5.00 g（精確到0.01 g）各3 份，分別加入不同體積的2 μg/mL 的鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺標準混合溶液，按1.4 的步驟進行樣品處理，處理成3 個不同的加標濃度，分別為80、100、160 ng/mL，每個質量濃度測6 次，測試的實驗數據見表3。測試標準品和樣品加標回收的色譜圖分別見圖3 和圖4。

表2 標準曲線及相關系數Table 2 Standard curve and correlation coefficient

圖1 鹽酸克倫特羅標準曲線Fig.1 Clenbuterol Standard curve

圖2 萊克多巴胺標準曲線Fig.2 Ractopamine Standard curve

表3 加標回收試驗結果及精密度結果（n=6）Table 3 The spike recovery test results and precision of the results（n=6）

圖3 鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺標準品色譜圖Table 3 Clenbuterol and ractopamine standard chromatogram

圖4 空白試樣中鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺加標色譜圖Table 4 Clenbuterol and ractopamine spiked chromatogram in figure of blank samples

4 討論

21 世紀以來，確證β-受體激動劑主要是用氣質聯用，液質聯用相對于氣質聯用的優點是樣品無需衍生化，離子的特征性也較強，提供的信息豐富，本文用液質聯用法研究快速測定鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺的殘留量，樣品處理過程簡單，分析方法的靈敏度高，精密度及回收率均可滿足實際工作的要求，具有一定的實際應用意義。

β-受體激動劑通常以游離和結合兩種形式存在，游離的β-受體激動劑在酸性條件下溶于水溶液，在堿性條件下溶于有機溶劑，生物材料中的β-受體激動劑因為動物機體的代謝，經過吸收、轉化，部分β-受體激動劑成為結合型，所以在測定之前，要用β-葡萄糖醛苷酸酶溶液酶解，使之游離出來才能提取完全。

動物組織樣品在測定中常會受到比較大的背景干擾，采用固相萃取法對樣品進行凈化，大大降低了雜質（主要是脂肪類物質）的干擾，起到良好的效果。在樣品中目標化合物是低濃度的情況下，也有足夠的檢測離子進行定量分析，不影響檢測效果。也可同時用于凈化樣品中含有的多種β-受體激動劑。采用固相萃取法的另一個好處是在實驗過程中，相比于液液萃取法來說減少了試劑的使用量，降低實驗成本，方便操作，也減低了有機溶劑的毒性對實驗操作者身體健康的危害。

本文研究用液質聯用法測定鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺的含量，通過質譜對樣品進行準確定性，分別以子離子m/z164.0 和m/z 203.0 做為定量離子，多反應離子監測模式（MRM）進行定量，分析精度好，回收率和重現性高，應用于質量檢測部門對鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺殘留量的檢測，效果滿意。

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[7]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會.GB/T 21313-2007 動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測方法液相色譜-質譜/質譜法[S].北京：中國標準出版社,2007