交叉引物等溫擴增技術檢測志賀氏菌

祁軍，張霞，2，蔣剛強，蔡國瑞，董亞學，鄭文杰，*

（1.天津出入境檢驗檢疫局，天津 300461；2.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；3.新疆出入境檢驗檢疫局，新疆烏魯木齊 830063）

志賀氏菌屬（Shigella）的細菌是一類具有高度傳染性的腸道致病菌，根據Igor G 等研究，在成年患者中，只要10 cfu～100 cfu 的志賀氏菌就可通過感染腸道而致病[1]，引發嚴重的炎癥反應；在幼兒可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。志賀氏菌主要通過食物或水經消化道傳播，導致食源性志賀氏菌流行，與志賀氏菌病相關的食品包括色拉、生蔬菜、奶及奶制品、水果、肉類、面包制品等。志賀氏菌可以分為痢疾志賀氏菌（S.dysenteriae）、福氏志賀氏菌（S.flexneri）、鮑氏志賀氏菌（S.boy dii）和宋內氏志賀氏菌（S.sonnei）。在發展中國家，由福氏志賀氏菌引起的感染性腹瀉疾病高居首位[2]。

國家標準對于食品中志賀氏菌的檢測方法需要2 d～3 d 才能得到初步結果，而隨著食品安全檢測標準的提高，尋找更加快速、準確、便捷的檢測技術顯得至關重要。志賀氏菌的檢測方法很多，ELISA、常規PCR檢測、實時熒光定量PCR、環介導等溫擴增、脈沖場凝膠電泳、RAPD、基因探針等技術均在志賀氏菌的檢測和研究中得到廣泛的應用[3-10]。

隨著生物實驗技術、免疫學技術以及分子生物學技術的發展，志賀氏菌的檢測和鑒定方法朝著快速簡便、靈敏性高、特異性強且經濟的方向發展。本研究應用一種新的交叉引物等溫擴增技術[11]，針對編碼4 個血清型的志賀氏菌主要毒力基因——侵襲性質粒抗原H 基因（ipaH），建立一種既有分子生物學檢測的高靈敏、高通量，又具有免疫學檢測的特異性好、操作簡捷，又不需要任何復雜儀器的快速檢測方法，以適用于基層實驗室和現場快速篩查檢測。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

dNTPs（Fermentas），10×Bst buffer（New England Biolabs），Bst DNA polymerase large fragment（New England Biolabs），MgSO4（Sigma），betaine（Sigma），核酸快速檢測試紙條（杭州優思達公司）。

菌株采用志賀氏菌6 株（4 株CMCC 菌株、樣品中分離出的2 株野生株）及32 株其他相關陰性菌，詳見表1。

1.2 主要儀器與設備

PCR 擴增儀（Biometra）、離心機（Eppendorf，5417R）、DNA/RNA/蛋白分析儀（BHIMUZDA，Bio Specmini）。

表1 試驗菌株Table 1 Bacterial strains for detection

1.3 方法

1.3.1 DNA 的提取及定量

痢疾志賀氏菌CMCC 51252 為試驗菌株，接種于10mL 營養肉湯中，37℃培養16h，取1mL 用于細菌基因組提取，利用紫外分光光度計檢測DNA 質量及純度。

1.3.2 引物及探針的設計

以志賀氏菌EU743831.1 的invasion plasmid antigen（ipaH2）基因DNA 序列為基礎，設計引物序列：

1.3.3 反應體系和反應條件

通過優化，反應體系為：10×ThermoPol buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.8 μL，100 mmol/L MgSO40.6 μL，5 mol/L Betaine 2 μL，8U/μL Bst DNA pol 1 μL，2μmol/L SHIF3/SHIB3 0.5μL/0.5μL，20 μmol/LSHICPR20.6 μL，20 μmol/L SHIDF5F/SHIDF5B 0.5 μL/0.5 μL，模板1 μL，ddH2O 補足至20 μL。

反應條件：64 ℃反應60 min。

1.3.4 特異性試驗

對表1 中菌株核酸樣本進行試驗，以證明檢測方法是否具有通用性及特異性。

1.3.5 靈敏度試驗

通過對過夜培養CMCC 51252 菌液取1 mL 做細菌計數，用PBS 對菌液進行10 倍梯度稀釋至10-8，取1 mL 提取細菌基因組做實驗模板。按照反應體系進行試驗，試驗重復六次。

1.3.6 干擾菌試驗

取大腸桿菌43046，沙門氏菌50041，陰溝腸桿菌45301 共3 株菌作為干擾菌株，營養肉湯培養菌液濃度大約為108cfu/mL 左右，進行10 倍梯度逐倍稀釋到濃度為107cfu/mL～101cfu/mL。

準備3 個錐形瓶，3 個瓶中接入終濃度分別為（1）103cfu/mL 51252+105cfu/mL43046；（2）103cfu/mL 51252+105cfu/mL50041；（3）103cfu/mL 51252+105cfu/mL 45301 3 種干擾菌混合。取1 mL 混合液提取DNA 做實驗模板，按照反應體系進行試驗。

1.3.7 實際樣品檢測

用該研究建立的檢測方法體系與現有國家標準檢測方法同時對來源于不同國家的不同種類食品的58 份實際樣品進行普查檢測，確定該檢測體系的假陽性率及假陰性率，客觀全面分析評估建立的檢測體系可操作性及準確率。

2 結果與分析

2.1 特異性試驗

檢測38 株實驗菌株，其中6 株志賀氏菌檢測全部為陽性，圖1 是志賀氏菌檢測結果；其余32 株陰性相關菌檢測為陰性，圖2 為部分腸桿菌科其他陰性菌株的試驗結果，說明該方法特異性良好,而且對于志賀氏菌檢測具有很好的通用性。

圖1 志賀氏菌特異性檢測Fig.1 Specificity of detecting Shigella strains

圖2 非志賀氏菌特異性檢測Fig.2 Specificity of detecting for non-Shigella bacterial strains

2.2 靈敏度試驗

2.2.1 純菌液靈敏度檢測

CMCC 51252 過夜菌液計數為7.3×108cfu/mL，用PBS 對菌液進行10 倍梯度稀釋至7.3×101cfu/mL，各取1 mL 提取細菌基因組做實驗模板，結果見圖3，靈敏度達到103cfu/mL。

圖3 志賀氏菌CMCC 51252 菌液靈敏度試驗Fig.3 Sensitivity of detecting Shigella CMCC51252 in pure culture

2.2.2 干擾菌試驗

對1.3.6 步驟的混合菌液進行檢測，試驗結果表明在干擾菌終濃度均達105cfu/mL 的情況下，檢測靈敏度沒有發生明顯變化，依舊為達103cfu/mL。

2.3 實際樣品檢測

對58 份實際樣品進行普查檢測，金標準的傳統生化檢測結果陽性樣品4 個，該檢測方法陽性結果6 個，兩種檢測方法結果大致相符，新建立的方法沒有漏檢情況，有可能出現假陽性，但發生率較低，適用于樣品檢測初篩要求。

3 結論

隨著食品安全檢測標準的提高，尋找更加快速、準確、便捷的檢測技術顯得至關重要。志賀氏菌的檢測方法隨著檢測技術的發展，將得到不斷地改進和完善，并朝著快速簡便、靈敏性高、特異性強且經濟的方向發展。

近年來，以分子生物學為基礎的微生物學檢測得到較快發展，與傳統檢測手段相比，能更快發現食品中存在的微生物安全隱患。交叉引物結合免疫金標試紙條檢測是一種新型的等溫擴增檢測方法，消除了PCR、實時熒光PCR 對儀器的依賴，同時與環介導恒溫擴增法（LAMP）相比，其檢測結果的觀察更為直觀、客觀、便捷，只需依據試紙條上檢測線的有無即可明確判定陰陽性結果，避免了環介導等溫擴增使用肉眼觀察沉淀或顏色變化的主觀性。該方法不需要儀器設備及其高度靈敏、特異及快速的優點對于普及分子生物學方法在基層和經濟不發達地區具有重要的意義。

本研究根據1987 年Buysse 等發現志賀氏菌侵襲性質粒抗原H（ipaH）[12]基因建立交叉引物恒溫擴增方法，具有較好靈敏度。該基因呈多拷貝存在于菌體的質粒或染色體上，是志賀氏菌檢測中常用到的目的基因。許龍巖等[13]根據ipaH 基因序列設計引物建立PCR方法，特異性高，能檢測出志賀氏菌屬的4 個種群；趙麗華等[14]利用分子信標PCR 方法以該基因為目的基因，檢測樣品準確率達到100%。本研究建立檢測檢測方法無論有無干擾菌，檢測靈敏度均可穩定達到103CFU/mL 可滿足樣品檢測需求。通過與金標準同時進行實際樣品檢測比較，結果大致相符，沒有漏檢情況出現，但有可能出現假陽性，發生率較低。實驗結果表明，該方法操作簡便，不需要特殊設備，適合于基層實驗室對于樣品的快速篩選檢測。

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