谷物中黃曲霉毒素B1檢測方法的研究

李海礁，喻東威，劉志楠，李欣，解鑫，劉曉川，趙媛，宋曉東，劉萍萍

（內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司質量安全管理系統中心實驗室，內蒙古呼和浩特 011500）

黃曲霉毒素是黃曲霉、寄生曲霉、特異曲霉和假溜曲霉4 種產毒菌株的代謝產物。飼料在自然條件下污染的黃曲霉毒素主要包括B1、B2、G1及G24 種，其中B1最多、G1次之，B2和G2很少[1]。因為黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1）的毒性與致癌性最大[2]。一般以AFB1作為飼料和糧食中黃曲霉毒素含量評價的主要指標，所以我國只針對污染范圍最廣、危害最大的AFB1制定了限量[3]，其中玉米、玉米油、玉米制品中的限量水平均為≤20 μg/kg。

自20 世紀90 年代以來，現有的檢測黃曲霉毒素B1的方法主要有薄層色譜法（TLC）、液相色譜法、液相色譜串聯質譜法和酶聯免疫法（ELISA）[4-5]。其中，TLC法是檢測黃曲霉毒素的經典方法，是中國測定食品及飼料中AFT 黃曲霉素B1（AFB1）的標準方法之一GB/T5009.23-2006《食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定》；高效液相色譜法采用單克隆抗體免疫技術，通過黃曲霉毒素免疫親和柱可以將黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2分別進行定量分析，所以此方法已被美國官方分析化學家協會（AOAC）確認為官方檢測方法；液相色譜串聯質譜法具有比高效液相色譜法更高的靈敏度和準確性，但這種方法還極少使用在測定組織中霉菌毒素的含量[6-7]；酶聯免疫法檢測AFB1的理論基礎是通過抗原抗體的特異性結合反應，其采用單克隆或多克隆抗體技術，具有特異性強、分析時間短的優點。

本實驗主要采用高效液相色譜法和酶聯免疫法，對SGS 能力驗證中心實驗室制備的同一含黃曲霉毒素B1陽性玉米粉樣品進行不同實驗室間檢測比對，意在對以上兩種方法進行對比研究。

1 材料與方法

1.1 材料

含黃曲霉毒素B1的玉米粉：SGS 能力驗證中心實驗室制備。

1.2 試劑與儀器

黃曲霉毒素B1快速定量檢測試劑盒：美國Helica公司；甲醇（色譜級）；苯（色譜純）；乙腈（色譜純）；氯化鈉（分析純）；磷酸氫二鈉（分析純）；磷酸氫二鉀（分析純）；氯化鉀（分析純）；吐溫-20/PBS 溶液（0.1%）；黃曲霉毒素B1標準儲備溶液：Supelcd 公司，LB92973，0.100 mg/mL；柱后衍生溶液（0.05%碘溶液）；

XS204 電子天平（感量0.1 mg）：Mettler Toledo 公司；ELX808 酶標儀：450 nm，BioTek 公司；微量可調移液器：100 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL，Brand 公司；八道移液器：30 μL～300 μL，Brand 公司；加樣槽；DZSB-0882 高速均質器：iUL 公司；黃曲霉毒素免疫親和柱：3 mL，VICAM；玻璃纖維濾紙（直徑11 cm，孔徑1.5 μm）；玻璃注射器（10 mL、20 mL）；高效液相色譜儀：戴安3000，帶熒光檢測器；色譜柱：Pickering 公司C18 柱。

1.3 方法

1.3.1 方法概述

酶聯免疫法：本方法測定的基礎是抗原抗體反應。微孔板包被有針對黃曲霉毒素B1的特異性單克隆抗體。加入黃曲霉毒素標準品或樣品溶液和黃曲霉毒素B1酶標記物競爭黃曲霉毒素B1抗體，之后底物溶液在酶的作用下，由無色變為藍色，最后加入終止液顏色由藍變為黃色，在450 nm 處測量吸光度值，并計算樣品中黃曲霉毒素B1的濃度含量。

高效液相色譜法[8]：試樣經過甲醇-水提取，提取液經過濾、稀釋后，濾液經過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有專一性，黃曲霉毒素交聯在層析介質中的抗體上。用水或吐溫-20/PBS 將免疫親和柱上雜質除去，以甲醇通過免疫親和層析柱洗脫，洗脫液通過帶熒光檢測器的高效液相色譜儀柱后碘溶液衍生測定黃曲霉毒素的含量。

1.3.2 樣品前處理

酶聯免疫法：取代表性的粉碎樣品5.0 g 與25 mL 70%甲醇溶液混合，強力振蕩3 min，2 ℃～8 ℃3 000×g離心10 min，取清液用于檢測（稀釋倍數為5）。

高效液相色譜法：準確稱取經過磨細（粒度小于2 mm）的試樣25.0 g 于250 mL 具塞錐形瓶中，加人5.0 g 氯化鈉及甲醇-水（7 ∶3，體積比）至125.0 mL，以均質器高速攪拌提取2 min。定量濾紙過濾，準確移取15.0 mL 濾液并加入30.0 mL 水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1 次～2 次，至濾液澄清，備用。

1.3.3 參考色譜條件

流動相：甲醇-水（45∶55，體積比）；流速：0.8 mL/min；柱后衍生化系統；衍生溶液：0.05%碘溶液；衍生溶液流速：0.2 mL/min；反應管溫度：700 ℃；反應時間：1 min。

1.3.4 檢測步驟

酶聯免疫法：取足夠數量的預混孔插入微孔架，每孔加入200 μL 酶標記物，100 μL 標準品溶液（0、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/kg）和樣品，并用移液器吹打至少3 次，充分混勻；轉移100 μL 預混孔中的液體至包被抗體的微孔中，室溫避光孵育15 min，洗板；加入100 μL 底物到微孔中，充分混合并在室溫暗處孵育5 min；最后加入100 μL 停止液到微孔中充分混合，并在450 nm 處測量吸光度值。

高效液相色譜法：用進樣器吸取100 μL 黃曲霉毒素B1標準工作液注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定標準溶液的響應值（峰高或峰面積），得到黃曲霉毒素B1標準溶液高效液相色譜圖。取樣品洗脫液1.0mL加入重蒸餾水定容至2.0 mL，用進樣器吸取100 μL 注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定試樣的響應值（峰高或峰面積）。經過與黃曲霉毒素B1標準溶液譜圖比較響應值得到試樣中黃曲霉毒素B1的濃度。

2 結果與分析

2.1 不同方法檢測結果數值統計情況

針對同一黃曲霉毒素B1陽性玉米粉樣品，在不同實驗室間通過HPLC 法和酶聯免疫法進行檢測，所得樣品檢測結果見表1 所示。

表1 不同實驗室間采用HPLC 法和ELISA 法檢測結果Table 1 The results among different laboratories by HPLC and ELISA

2.2 不同檢測方法檢測結果與平均值的偏差情況

針對以上不同方法的檢測結果與樣品平均值進行橫向比較，橫線為不同方法的平均值，具體結果見表2、圖1 和圖2。

表2 不同方法檢測結果與平均值的偏差情況Table 2 The deviation between detection results and the mean result

圖1 HPLC 法檢測結果分布圖Fig.1 The assay results of HPLC

圖2 ELISA 法檢測結果分布圖Fig.2 The assay results of ELISA

表1、表2、圖1 和圖2 結果顯示：同一樣品不同實驗室檢測結果，HPLC 法檢測結果范圍在12.55 μg/kg～17.43 μg/kg 之間浮動，平均值為15.65 μg/kg，相對標準偏差為10.90%；ELISA 法檢測結果范圍在14.10 μg/kg～18.20 μg/kg 之間浮動，平均值為15.24 μg/kg，相對標準偏差為8.83%；由以上數據可以得到ELISA 法與HPLC 法檢測谷物中的黃曲霉毒素B1時，實驗結果非常一致，結果偏差較小。

3 討論

通過ELISA 法和HPLC 法所得玉米粉中黃曲霉毒素B1的檢測結果可以看出，ELISA 法與HPLC 法檢測結果都比較穩定，而且兩種方法的檢測結果也非常一致，由此可見ELISA 法與HPLC 法均可以用于檢測谷物中黃曲霉毒素B1的檢測。

自20 世紀90 年代以來，就高效液相色譜法而言，該方法通過預固相多功能萃取柱、免疫親和柱進行前處理，并結合柱前、柱后衍生，采用熒光檢測器對樣品進行測定，有檢測靈敏度高、選擇性好等優點，但該方法存在前處理步驟繁瑣，操作復雜，而且不能進行大量樣本同時測定[9]，所以極大的限制了HPLC 法檢測黃曲霉毒素B1的應用范圍。而ELISA 法在進行樣品檢測時，樣品前處理簡單，操作簡便，方法快速，檢測結果準確、穩定，而且檢測成本較低，設備場所要求低，樣品隨到隨檢，并且還可以同時處理大量樣本進行檢測等優點[10]，所以在檢測谷物中黃曲霉毒素B1時，ELISA法將會得到更廣泛應用。

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[5]宋歡.液相色譜法測定飼料中的黃曲霉毒素B1[J].山西農業大學學報,2001(3)：257-258

[6]李佐卿,謝東軍,孫大為,等.免疫親和柱HPLC 熒光檢測酒中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2[J].光譜實驗室,2001,18(1)：28-31

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