鹽鹵濃漿豆腐凝膠形成作用力的研究

周淑紅，陳野，張敏，劉君，王君予，郭爽

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

大豆是蛋白質含量最高的植物之一，含有人體必需的8 種氨基酸。中國傳統的豆制品以豆腐及豆腐制品為主，在豆腐加工過程中，產生大量營養豐富的黃漿水，然而，目前我國大多數企業將黃漿水直接排放，不僅沒有充分利用其營養價值，而且對環境造成污染，不利于增加大豆加工附加值和清潔生產[1]。

蛋白質凝膠是變性蛋白質分子間排斥和吸引相互作用力相平衡的結果，形成和維持蛋白質凝膠的主要作用力是靜電相互作用、二硫鍵、疏水相互作用、氫鍵等物理作用力[2]。氫鍵、疏水相互作用、鹽鍵、范德華力都是非共價鍵，鍵能雖然小，但由于數量大，并且具有加和性，因此是蛋白質之間不可忽視的作用力。使用不同的凝固劑形成的凝膠分子間作用力不同，目前對葡萄糖酸內酯（GDL）和硫酸鈣豆腐凝膠研究較多，Hashizume 等[3-4]認為，對GDL 和硫酸鈣豆腐凝膠的形成起重要作用的是二硫鍵、氫鍵和疏水相互作用。但Kohyama 等[5]認為，豆漿凝固時，由于pH 偏酸性，不利于疏基與二硫鍵的交換反應，因此在豆漿凝固過程中很難形成新的二硫鍵。此外，由于生豆漿只能形成沉淀，不能形成豆腐凝膠，所以氫鍵不可能是豆漿凝固的主要作用力：大豆蛋白之所以能夠形成豆腐凝膠，主要是由于大豆蛋白變性后，暴露出疏水基團，于是在疏水相互作用下大豆蛋白分子相互結合，形成了豆腐凝膠。然而，對鹽鹵豆腐凝膠的分子間作用力研究較少，其凝膠形成機制與GDL 或硫酸鈣豆腐凝膠是否相同仍未知。

目前主要用間接手段研究蛋白質凝膠過程中分子間的作用力，通過添加可以增強或削弱蛋白質分子間作用力的試劑觀察凝膠特性的變化，如添加強的表面活性劑十二烷基磺酸鈉（SDS）可以破壞疏水作用[6]，而氯化鈉等高溶解度的鹽類可以破壞蛋白質分子間的靜電引力[7]。

本研究采用濃縮方法，進而省去在豆腐的制備工藝中排出黃漿水這一工序制備濃漿豆腐，并且試圖通過添加可影響特定化學作用力的氯化鈉，DTT，SDS，脲等試劑考察其對豆腐凝膠質構特性的影響，分析各種化學作用力對穩定豆腐凝膠結構的重要性，這對掌握豆腐凝固機理，確定豆腐加工條件，無疑具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大豆：市售；鹽鹵（食品級）：天津長蘆海晶集團有限公司；氯化鈉、鹽酸、甘氨酸，EDTA，尿素、DTT、、SDS、脲等試劑均為分析純。

1.2 試驗設備

RE-3000A 真空旋轉薄膜蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；磨漿機：北京京美華研科技有限公司；TA-XT plus 型質構儀：北京微訊超技儀器技術有限公司；HH數顯恒溫水浴鍋：金壇市金城國勝實驗儀器廠；756PC UV 系列紫外可見分光光度計：天津市普銳斯儀器有限公司；RF-5301 熒光分光光度計：島津公司；PHS-25 pH 計：上海今邁儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 濃漿豆腐的工藝流程

挑選顆粒飽滿的優質大豆，按大豆干重∶水=1 ∶3的比例浸泡12 h 左右（20 ℃），使浸泡好的豆重約為干豆重2.2 倍～2.3 倍。按干豆重∶水=1 ∶8 的比例進行兩次磨漿，過濾，濃縮至豆漿的蛋白質濃度約為10%。蒸汽加熱至95 ℃保持5 min，冷水快速冷卻，加入0.6%（w/v）的鹽鹵，快速攪拌均勻，90℃下水浴加熱30 min，凝固成型，冷卻30 min 后得到濃漿豆腐。

1.3.2 凝膠強度的測定方法

將上述制備的豆腐凝膠在冷藏箱（4 ℃）中靜置10 h 后，取出于室溫下放置1 h，用質構儀的TPA 模式測定其凝膠特性。采用P0.5 的探頭，測前速度5 mm/s，檢測速度1 mm/s，測后速度1 mm/s，時間5 s，力5.0 g，距離5 mm。每個樣品平行試驗3 次。

1.3.3 鹽鹵豆腐凝膠形成過程中巰基含量的測定

1.3.3.1 樣品制備

將濃縮好的生豆漿加熱至95 ℃保持5 min，冷水快速冷卻，加入鹽鹵并攪拌均勻，90 ℃水浴，分別加熱0、10、20、30、40、60 min 時取樣。

1.3.3.2 巰基含量的測定

分別取上述制備的豆腐凝膠樣品1 g，加入緩沖液（每升溶液含Tris 10.4 g，甘氨酸6.99 g，EDTA1.2 g，尿素480 g，pH=8.0）15 mL，均質1 min，在4 000 r/min下離心15 min，取上清液，濾渣中繼續加緩沖液5 mL，4 000 r/min 下離心15 min，取上清液，合并前后兩次的上清液。取合并后的上清液1 mL+緩沖液2.0 mL+Ellman 試劑0.02 mL，25 ℃保溫5 min，在412 nm 下，用分光光度計測定溶液吸光值。實驗以不加樣品，而加Ellman 試劑為空白，以不加Ellman 試劑，而加樣品的溶液確定其混濁度。

1.3.4 鹽鹵豆腐凝膠形成過程中表面疏水性的測定

1.3.4.1 制備樣品

制備方法與上述測定巰基含量樣品的制備方法相同。

1.3.4.2 表面疏水性的測定

采用ANS 熒光探針法。取3g 豆腐凝膠溶于150mL的0.01 mol/L 磷酸緩沖液中，然后在均質機上均質4 min，然后在5 000 r/min 下離心15 min，取上清液，用考馬斯亮蘭法測定溶液中蛋白質的濃度。然后再使用磷酸緩沖液將上清液稀釋至0.02 mg/mL～0.10 mg/mL之間。然后，取不同濃度的樣品溶液10 mL，采用熒光分光光度計在330.0 nm 的激發波長（狹縫寬度10.0 nm）和467.0 nm 的發射波長（狹縫寬度3.0 nm）下測定樣品的熒光強度（FI0），以及樣品中加入50 μL 濃度為8 mmol/L 的ANS 溶液后的熒光強度，振蕩，靜置10 min后測其熒光強度（FI1）。FI1和FI0的差值記為FI。以熒光強度對蛋白質濃度作圖，初始段的斜率即為蛋白質分子的表面疏水性指數。

2 結果與分析

2.1 分子間靜電作用對鹽鹵豆腐凝膠質構特性的影響

2.1.1 氯化鈉對鹽鹵豆腐凝膠質構特性的影響

氯化鈉對凝膠硬度和彈性的影響分別如圖1 和圖2所示。可知，隨著氯化鈉濃度的增加，鹽鹵豆腐的硬度呈現先增加后降低的趨勢，在氯化鈉濃度達到5 mmol/L 時，硬度達到最大值。而彈性趨勢與之相反，即先降低后增加，在氯化鈉濃度達到5 mmol/L 時，彈性為最小值。

圖1 氯化鈉濃度對凝膠硬度的影響Fig.1 Effect of NaCl concentration on on the hardness of gel

圖2 氯化鈉濃度對凝膠彈性的影響Fig.2 Effect of NaCl concentration the the springiness of gel

這是因為氯化鈉在較低濃度（≤5 mmol/L）時，具有電荷中和的作用，其加入有利于中和豆腐凝膠表面的負電荷，降低肽鏈間的靜電斥力，有利于凝膠的形成，因而凝膠硬度增加。氯化鈉還可以使蛋白質的水化作用增強，破壞蛋白質間的次級鍵[6]，因此，當氯化鈉超過一定濃度，蛋白質的水化作用逐漸加強，阻礙蛋白質分子間的凝聚，不利于凝膠的形成，使得凝膠強度降低。

2.1.2 pH 對鹽鹵豆腐凝膠質構特性的影響

pH 對凝膠硬度和彈性的影響分別如圖3 和圖4所示。

圖3 pH 對凝膠硬度的影響Fig.3 Effect of pH on the hardness of gel

圖4 pH 對凝膠彈性的影響Fig.4 Effect of pH on the springiness of gel

由圖可知，pH 由6.0 增加到9.0 的過程中，凝膠硬度呈現先增加后降低的趨勢，在pH=7.0 時，凝膠硬度達到最大值。而彈性則隨著pH 增加而降低。當pH 遠離等電點時，蛋白質分子帶有同種電荷，相互排斥力占主導，當靜電排斥力與蛋白分子變性后暴露的疏水基團之間的吸引力達到平衡時，凝膠形成。因此pH 越高，游離水量越少，形成的豆腐凝膠情況越好，但pH過大會導致蛋白質分子變性[8]。

2.2 二硫鍵對鹽鹵豆腐凝膠質構特性的影響

2.2.1 二硫蘇糖醇（DTT）對鹽鹵豆腐凝膠質構特性的影響

DTT 對凝膠硬度和彈性的影響分別如圖5 和圖6所示。

圖5 DTT 濃度對凝膠硬度的影響Fig.5 Effect of DTT concentration on hardness of gel

圖6 DTT 濃度對凝膠彈性的影響Fig.6 Effect of DTT concentration on the the the springiness of gel

由圖可知，隨著DTT 濃度的增加，鹽鹵豆腐凝膠的硬度呈現下降趨勢，且低濃度范圍內下降趨勢較大，隨著DTT 濃度的增加，下降趨緩。DTT 是常用還原劑，有抗氧化作用，可以穩定蛋白質的活性，同時又是蛋白質變性劑，可破壞二硫鍵，抑制二硫鍵的生成。有報道稱，蛋白質中的二硫鍵經還原反應形成巰基后，蛋白質構象將變得松散[9]。由如圖5 可以看出，在DTT存在下，鹽鹵豆腐凝膠的硬度降低。這說明凝集時發生了巰基的氧化，二硫鍵的生成對凝膠強度有一定的影響。

2.2.2 鹽鹵豆腐凝膠形成過程中巰基含量的變化

鹽鹵豆腐凝膠形成過程中巰基含量的變化如圖7所示。

圖7 鹽鹵豆腐凝膠形成過程中巰基含量的變化Fig.7 Changes of the sulfhydryl content during bittern tofu gel formation process

由圖7 看出，隨著凝固時間的延長，巰基含量基本呈下降趨勢。巰基含量在凝膠凝固過程中降低，說明在水解過程中一些游離的巰基發生氧化，生成了二硫鍵。二硫鍵是共價鍵，鍵能大于疏水作用和氫鍵。二硫鍵，尤其是鏈間二硫鍵的生成對穩定和增強凝膠結構具有重要的作用[10]。

2.3 疏水相互作用對鹽鹵豆腐凝膠質構特性的影響

2.3.1 十二烷基硫酸鈉（SDS）對鹽鹵豆腐凝膠質構特性的影響

SDS 對凝膠硬度和彈性的影響分別如圖8 和圖9所示。

圖8 SDS 對凝膠硬度的影響Fig.8 Effect of SDS concentration on the hardness of gel

圖9 SDS 對凝膠彈性的影響Fig.9 Effect of SDS concentration on the springiness of gel

由圖可知，隨著SDS 質量分數的增加，鹽鹵豆腐凝膠的硬度呈緩慢增長趨勢，當SDS 的質量分數達到0.09%時，凝膠的硬度達到了最大值。同樣，彈性也隨SDS 質量分數增加而增大。SDS 是一種強的親水表面活性劑，加入后可以破壞蛋白質分子的疏水結合[6]，有助于肽鏈的充分展開和疏水基團的暴露，使蛋白溶液的疏水性增大，有利于凝膠網絡的形成。另外溶液的疏水性的增大，有利于鏈間二硫鍵的形成，從而有助于凝膠結構的穩定。

2.3.2 鹽鹵豆腐凝膠形成過程中表面疏水性的變化

鹽鹵豆腐凝膠形成過程中表面疏水性的變化如圖10 所示。

圖10 鹽鹵豆腐凝膠形成過程中表面疏水性的變化Fig.10 Changes of the surface hydrophobicity during bittern tofu gel formation process

隨著鹽鹵豆腐凝膠形成時間的延長，凝膠的表面疏水性指數S0呈先增加后下降的趨勢，當凝膠時間為30 min 時，表面疏水性指數達到最大值。這可能是因為隨著凝固時間的延長，蛋白質的變性程度增大，疏水區域暴露在外，促進蛋白質通過疏水相互作用形成凝聚體。但是當凝固時間過長時，蛋白質通過疏水相互作用交聯的機會增多，表現為表面疏水性指數降低，參與豆腐凝膠形成的疏水性基團減少，導致豆腐的凝膠強度降低[11]。

2.4 氫鍵對鹽鹵豆腐凝膠質構特性的影響

脲對凝膠硬度和彈性的影響分別如圖11 和圖12所示。

由圖可知，隨著脲濃度的增加，鹽鹵豆腐凝膠的硬度呈現顯著下降趨勢，彈性也呈現下降趨勢。當脲的濃度為0.05 mol/L 時，凝膠硬度顯著下降，繼續增加脲的濃度，則凝膠無法形成。

圖12 脲的濃度對鹽鹵豆腐凝膠彈性的影響Fig.12 Effect of urea concentration on the springiness of gel

煮沸后蛋白質變性，肽鏈展開隨機排列，破壞了原來的氫鍵，原來形成氫鍵的基團暴露，暴露的氫鍵基團促進展開的肽鏈相互聚集，氫鍵的結合使得肽鏈形成穩定結構。當加入一定濃度的脲后，脲與肽鏈間的氫鍵基團結合，肽鏈上的氫鍵基團被屏蔽，影響肽鏈間氫鍵的形成。因此，凝膠的硬度及彈性顯現下降趨勢，甚至不能形成凝膠。

實驗數據表明隨著脲濃度的增大，脲對肽鏈間氫鍵形成的影響加大，由此可以看出氫鍵是豆腐凝膠形成的分子間作用力之一，并且對豆腐凝膠的形成有重要的影響[8]。

3 結論

通過對不同pH 以及NaCl 濃度對鹽鹵凝固豆腐凝膠過程的影響的研究，結果表明：在腐凝膠形成過程中離子鍵的作用較大，凝膠的形成需要克服蛋白質分子間的靜電斥力。通過DTT 對鹽鹵凝固豆腐凝膠過程中的影響以及巰基含量變化的研究可知，二硫鍵在凝膠形成過程中的起著重要作用，能夠較大的促進凝膠的形成。結合SDS 對鹽鹵豆腐凝膠的影響以及疏水性的測定，可見疏水相互作用對豆腐凝膠有顯著的作用。脲的添加也證實了氫鍵對形成凝膠的重要影響。因此，在鹽鹵濃漿豆腐凝膠形成中，靜電相互作用，二硫鍵，疏水相互作用以及氫鍵對凝膠的形成都具有重要作用。

[1]唐鑫,陳卓然,黃薪安,等.豆制品生產中黃漿水的綜合應用[J].農產品加工,2010(6)：67

[2]董秋穎,楊玉玲,許婷.從質構學角度研究肌原纖維蛋白凝膠形成的作用力[J].食品與發酵工業,2009,35(5)：45

[3]Hashizume K,Maeda M,Watanabe T.Relationships of heating and cooling condition to hardness of tofu[J].Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi,1978,25：387-391

[4]Hashizume K,Ka G.Difference between tofus coagulated with glueono-delta-lacton and calcium salts[J].Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi,1978,25(7)：383-386

[5]Kohyama K,Sano Y,Doi E.Reological characteristics and gelation mechanism of tofu (soybean curd)[J].J Aghe Food Chem,1995,43：1808-1812

[6]沈同,王鏡巖.生物化學[M].2 版.北京：高等教育出版社,1990：34-37

[7]RENKMA J M S,LAKEMOND C M M,JONGH H H J,et al.The effect of pH on heat denaturation and gel forming properties of soy proteins[J].Biotechnology,2000,79：223-230

[8]CHEFTEL C,CUQ J L,LORIENT D.Amino acids,peptides and pmteins[M].FEUNENM O R.Food Chemisty,1993：275-414

[9]田悅,社軍保.二硫鍵和巰基在蛋白質結構功能中的作用及分析方法[J].實用兒科臨床雜志,2007,22(19)：1499-1501

[10]Cherry J P.Protein Functionality in Foods (ACS Symposium Series 147)[M].Washington：American Chemistry Society,1981：136-137

[11]李里特,汪立君,李再貴,等.大豆蛋白熱變性程度對豆腐品質的影響[J].中國糧油學報,2002,17(1)：3