紫背天葵總黃酮分離純化工藝的研究

李巧云，洪小谷

（1.閩南師范大學成人教育學院，福建漳州 363000；2.漳州市環境監測站，福建漳州 363000）

紫背天葵（Begonia fimbristipula），學名紫背菜，又稱紅鳳菜，此菜口感鮮嫩，營養豐富，具有充足的維生素群和礦物質，經常食用具有中醫食療保健的神奇療效，可清熱解毒、消炎消腫、止咳潤燥[1]，近年來還發現其組成成分中含有具有生物活性的可以抗腫瘤以及惡性細胞增長的黃酮類化合物[2]，能夠延緩衰老。目前提取和分離純化黃酮類化合物的工藝很多，AB-8 大孔樹脂具有良好的吸附性能，解吸方便，能夠避免無機物的影響，可循環再生使用，作為一種新型的分離技術[3-8]目前已被廣泛用于銀杏等多種植物黃酮類化合物的分離提純中，但在紫背天葵總黃酮的提取中還鮮見報道。通過研究靜態吸附中吸附的時間，樣液的pH 以及溶劑的體積分數和溫度，解吸附中乙醇的體積分數等單因素試驗，得出大孔吸附樹脂對紫背天葵總黃酮的最佳分離純化條件；同時研究大孔樹脂對總黃酮樣液的解吸曲線，掌握黃酮類化合物的吸收區段，從而為將來對紫背天葵中黃酮的組分進行性質鑒定提供相關的實驗參考。

1 材料與設備

1.1 試驗材料

紫背天葵：本地產，采自于漳州師范學院植物園內；

主要試劑：亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉，均為分析純AR；蘆丁對照品由中國藥品生物制品檢定所提供；AB-8 大孔吸附樹脂。

1.2 試驗儀器

HH-4 型數顯恒溫水浴鍋、85-2 型恒溫磁力攪拌器：江蘇金壇江南儀器廠；752P 型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器；HH-4 型電動粉碎機：天津泰斯特；SHB-III 型循環水式多用真空泵：鄭州長城科技；R307型旋轉蒸發儀：上海生申科技；BSZ-100 型自動部分收集器：鄭州南北儀器；BSⅡOS 型電子分析天平：賽多利斯；DHG-9053A 型電熱鼓風干燥箱：上海成順；KH-100SP 型雙頻數控超聲波清洗器：昆山超聲儀器；100-1000 ul/1-5 ml 微量可調單道移液器：芬蘭雷柏。

2 試驗方法

2.1 樣品制備

紫背天葵全草洗凈，于80 ℃烘干，將已經干燥的紫背天葵放入電動粉碎機中進行粉碎，過40 目篩，得到干燥粉末。

2.2 紫背天葵黃酮類化合物提取方法

精確稱取10 g 的紫背天葵樣品粉末置于圓底燒瓶中，用300 mL 的70%乙醇溶液在60 ℃的水浴中浸提2 h，趁熱抽濾。依法多做3 次以制備更多的黃酮粗提液，合并濾液。將得到的濾液在65 ℃下進行旋轉蒸發濃縮，所得到的濃縮液用70%乙醇定容至200 mL，得到紫背天葵黃酮類化合物粗提液。冷藏保存備用。

2.3 紫背天葵黃酮類化合物測定方法

2.3.1 蘆丁標準曲線的繪制

精密稱取蘆丁標品80 mg，用體積分數70%乙醇微熱溶解，冷卻后轉移至100 mL 容量瓶中并定容至刻度，充分搖勻，得到0.8 mg/mL 標準溶液。精密吸取標準溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加質量分數5 %NaNO22.0 mL，搖勻、放置6 min 后，加質量分數10 %AlNO32.0 mL，搖勻，放置6 min，再加質量分數4%NaOH 20 mL，最后加70%乙醇定容至刻度，充分搖勻，放置15 min，以空白試劑做參比液，用分光光度計在510 nm 處測定吸光度[20]，以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標，以吸光度值A 為縱坐標，繪制出標準曲線，求出回歸方程。

2.3.2 總黃酮類化合物含量的測定

精密吸取粗提液5.0 mL，置于50 mL 容量瓶中，加質量分數5%NaNO22.0 mL，搖勻、放置6 min 后，加質量分數10%AlNO32.0 mL，搖勻，放置6 min，再加質量分數4%NaOH 20 mL，最后加70%乙醇定容至刻度，充分搖勻，放置15 min，以空白試劑做參比液，用分光光度計在510 nm 處測定吸光度[3]，按照標準曲線所得回歸方程計算濃度，再根據公式（1）計算紫背天葵總黃酮的提取率[4]。

式中：C 為黃酮類化合物的質量濃度，（mg/mL）；V1為原提取液體積，mL；D 為提取液稀釋的倍數（實驗中D=125）；M 為提取用的紫背天葵粉末的質量，g。C 可依據所測溶液的吸光度值A510，代入回歸方程算出其值。

2.4 大孔吸附樹脂的預處理及其性能指標測定

2.4.1 樹脂預處理

稱取一定量的AB-8 大孔吸附樹脂，先用95%的乙醇浸泡24 h，然后用乙醇洗脫，收集部分洗出液，加水檢驗，當洗出液在加水時無白色混濁現象時可停止乙醇洗滌，接著用去離子水將大孔樹脂的乙醇洗盡，加入5%鹽酸，浸泡3 h，再用去離子水將大孔樹脂清洗，直至中性時停止，加入5 %氫氧化鈉溶液，浸泡3 h，同法洗至中性停止，過濾，注意盡量將去離子水濾干，預處理完畢。將處理好的大孔吸附樹脂至于真空泵內抽氣，備用[5]。

2.4.2 靜態吸附率的測定

稱取已經預處理完畢的大孔吸附樹脂2 g，置于100 mL 三角燒瓶中，接著加入30 mL 樣品粗提溶液，放置臺式恒溫振蕩器中，室溫下振蕩24 h，待其充分吸附后，過濾，按照2.3.2 方法，測定過濾后的濾液中總黃酮的濃度[6]，并根據下列公式（2）測定靜態吸附率。

式中：C1為吸附濃度，（mg/mL）；C2為吸附后剩余液濃度，（mg/mL）。

2.4.3 解靜態吸附的測定[7]

在靜態吸附的飽和大孔樹脂中，加入50 mL 95%乙醇溶液，放置臺式恒溫振蕩器中，室溫下振蕩24 h，待其充分解吸附后，過濾，按照2.3.2 方法，測定過濾后的濾液中總黃酮的濃度。并根據公式（3）計算洗脫率。

2.5 分離參數優化研究

2.5.1 樹脂分離實驗操作

稱取AB-8 大孔吸附樹脂100 g，用95%乙醇濕法裝柱，將樹脂全部裝入層析柱（40 mm×30 cm）中，接著準確量取10 mL 紫背天葵黃酮粗提液，將提取液用大孔吸附樹脂的交換柱吸附，等待其完全吸附后用去離子水洗脫，接著再用95%的乙醇解吸，利用自動部分收集器進行收集，注意控制流速，每管收集3 mL 為宜，并將試管編號，按照以上步驟收集后，分別吸取1 mL 收集液，并測量它們的吸光度值。根據所測得的數據制作AB-8 大孔吸附樹脂柱層析的色譜圖，通過該圖譜我們還可以分析出紫背天葵中黃酮類物質的種類。

2.5.2 單因素試驗

分別改變靜態吸附的條件，即在其他條件不變的情況下，分別改變吸附的時間、樣液的pH 以及吸附時的溫度[8]，按照上述2.4.2 中的方法對紫背天葵中黃酮類化合物進行吸附，考察它們對吸附效果的影響。得到最佳工藝參數，并根據公式（3），確定最優洗脫率。

2.5.3 正交試驗

根據單因素的實驗結果，對影響黃酮類化合物吸附效果的3 個因素，選取A：樣液的pH（5.0、6.0、7.0）、B：吸附溫度（20、25、30 ℃）、C：吸附時間（4、8、12 h）進行L9（33）正交試驗。正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 The factor and level of orthogonal experiment

3 結果與分析

3.1 樣品粗提液總黃酮的含量

根據試驗所得標準曲線回歸方程y=10.782x+0.011 4（r2=0.998 5）計算樣品液濃度，結果在510 nm 下測得紫背天葵總黃酮粗提液的吸光度值為y=0.212，經計算可得粗提液濃度x=0.018 65 mg/mL，所得的200 mL粗提液中黃酮的總濃度為0.932 4 mg/mL，相對紫背天葵樣品粉末黃酮含量為0.47%。

3.2 靜態吸附率的測定

根據試驗2.4.2 及標準曲線回歸方程計算，濾液中黃酮類化合物的吸光度值y2=0.107，可計算吸附后黃酮的濃度C2=0.008 9 mg/mL，代入公式（2），可得出樣品溶液的吸附率為52.2%。

3.3 靜態解吸附的洗脫率

根據3.2 所得的結果以及2.4.3 的步驟，將充分解吸后所得的黃酮類化合物的吸光度值y=0.077 代入標準曲線回歸方程中，經換算成洗脫液黃酮的含量為0.006 1 mg/mL，代入公式（3），可得出樣品溶液的洗脫率為62.7%。

3.4 紫背天葵總黃酮的動態研究以及動態曲線

按照試驗2.5.1 所述方法進行試驗，收集共39 支試管的解吸液，分別取1 mL 測定它們的吸光度值，在作出AB-8 柱層析的色譜圖，見圖1。

圖1 AB-8 柱層析色譜圖Fig.1 AB-8 column chromatography chromatograms

由圖1 可以看出，經過AB-8 大孔樹脂吸附黃酮類化合物所得出的色譜分析圖只出現了一個吸收峰，這說明紫背天葵中黃酮的種類大致相同，故為將來進一步鑒定紫背天葵黃酮的性質奠定了基礎，無需再分開收集紫背天葵中的黃酮類物質。

3.5 不同因素對紫背天葵總黃酮純化影響的研究

根據試驗2.5.2 所述方法分別改變靜態吸附的條件，即在其他條件不變的情況下，分別改變吸附的時間、樣液的pH 以及吸附時的溫度，對紫背天葵中黃酮類化合物進行吸附，考察它們對吸附效果的影響。得到最佳工藝參數。

3.5.1 吸附時間

在不改變樣液pH 和吸附溫度的情況下考察時間對吸附率的影響，考察1 h～10 h 內所收集的各樣液的吸光度值，并制作出時間-吸光度值關系曲線，得到結果如圖2。

圖2 吸附時間對吸附率的影響Fig.2 Effect of aborsobing time on the absorbing capacity

由圖2 可以看出，在一定的時間內，隨著時間的延長，吸光度值逐漸降低，說明黃酮被AB-8 大孔樹脂吸附之后濃度逐漸開始降低，樹脂的吸附率增加，但是到達一定的時間之后，吸附率就穩定在一個狀態中不再增加，這是因為大孔樹脂的吸附量已趨于飽和，在這種情況下樹脂將不再吸附，吸附率就不再變化了。因此，我們可以認為AB-8 大孔吸附樹脂吸附紫背天葵總黃酮的最佳時間應控制在7 h～8 h。

3.5.2 原料液pH 對吸附率的影響

原樣液的pH 為6.3，我們用5 %的氫氧化鈉和1 mol/L的鹽酸將樣液的pH 分別調至4.0、5.0、6.0、7.0各30 mL，然后分別加入2 g AB-8 大孔吸附樹脂。置于震蕩器上24 h，過濾得到濾液，測定濾液中黃酮的吸光度值，并制作出pH 與吸光度值的關系曲線，得到結果見圖3。

由圖3 可以看出，樣液的pH 為6 的時候，吸附效果是最好的，這是因為根據大孔樹脂的吸附原理，吸附過程中吸附介質以分子狀態被吸附，保持好吸附介質的分子狀態是保證良好吸附效果的基礎。在一般情況下，溶液為酸性時，吸附效果最好，但這個酸度僅限于弱酸，酸性太強時，可能會導致吸附物質化學結構產生變化。

圖3 pH 對吸附率的影響Fig.3 Effect of pH on the absorbing capacity

3.5.3 溫度對吸附量的影響

分別取原樣液30 mL 4 份，加入AB-8 大孔吸附樹脂2 g，在pH 保持6.3 的情況下置于恒溫震蕩器上振蕩24 h，溫度分別設置為20、25、30、35 ℃，24 h 后過濾出濾液，測定濾液中黃酮的吸光度值，并制作出溫度與吸光度值的關系曲線，得到結果見圖4。

圖4 溫度對吸附率的影響Fig.4 Effect of temperature on the absorbing capacity

從圖4 我們看出，當溫度在25 ℃時，大孔吸附樹脂吸附紫背天葵總黃酮的吸附量比其他3 個溫度的吸附量更高，且溫度適中，基本能夠保證黃酮的性質不因溫度因素而發生變化，在實驗中25 ℃接近室溫容易控制，故我們可以將AB-8 大孔吸附樹脂吸附紫背天葵總黃酮的溫度確定在25 ℃[8]。

3.6 紫背天葵總黃酮純化最佳工藝的研究

紫背天葵總黃酮純化最佳工藝的研究見表2。

由表2 結果可知，RB＜RA＜RC，即條件B（吸附溫度）對紫背天葵黃酮類化合物吸附效果的影響最大，A（pH）其次，影響最弱的是C（吸附時間）。因此可下結論，當A2B2C3的情況下，即pH 為6，吸附溫度25 ℃、吸附時間12 h 時，AB-8 大孔樹脂紫對背天葵總黃酮的吸附率較高。但是由于單因素試驗時，吸附時間8 h 和12 h 吸附效果差別不大，而正交實驗表明吸附時間對吸附率的影響也最弱，為了節約時間和資源能效，我們還是將pH 為6，吸附溫度25 ℃、吸附時間8 h 確定為最佳純化的工藝條件。

表2 吸附條件的正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal experiment

4 結論

1）采用AB-8 大孔吸附樹脂分離純化紫背天葵總黃酮，單因素試驗研究了吸附時間、上樣液pH 以及吸附溫度對其吸附率的影響。單因素試驗表明最適分離條件為：吸附時間7 h～8 h、樣液pH 6 和溫度25 ℃。

2）通過正交試驗分析，確定分離純化紫背天葵總黃酮最佳工藝參數為：吸附時間8 h，樣液pH6，溫度25 ℃。在此條件下，樣品溶液吸附率為52.2%，洗脫率為62.7%。

[1]郭長江.食物類黃酮物質的營養學意義[J].中國食物與營養,2004,21(3)：38-40

[2]張林和,屠春燕,于文濤,等.紫背天葵中營養成分及總黃酮分析[J].氨基酸和生物資源,2004,26(3)：3-5

[3]劉志勤,曹瑋國.青海枸杞葉總黃酮含量的測定[J].青海科技,2004,48(1)：46-47

[4]韓兆軒,王維民.大孔樹脂純化菠蘿皮黃酮類化合物的研究[J].廣東海洋大學學報,2009,29(3)：91

[5]楊國榮,錢錦花,倪朝敏,等.AB-8 大孔吸附樹脂分離提取魚腥草總黃酮的研究[J].廣東化工,2009,36(5)：132-133

[6]王慧彥,方蕓,王妍,等.AB-8 大孔樹脂對槐花總黃酮吸附性能研究[J].食品科學(工藝技術),2009,30(20)：147-149

[7]陸英,李潔.大孔樹脂分離純化鼠兒草中黃酮類化合物研究[J].湖南農業大學學報：自然科學版,2009,35(5)：498-499

[8]劉飛,趙瑩.大孔吸附樹脂及其在天然產物分離純化中的應用[J].齊魯藥事,2008,127(11)：680