超聲波輔助提取法測定茶葉中咖啡因

劉華戎，董文明

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)校團(tuán)委，云南昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201）

茶葉中含有多種生物堿，其咖啡因的含量占茶葉干物質(zhì)總量的2.0%～5.0%，咖啡因亦稱咖啡堿，化學(xué)名稱為1，3，7-三甲基-2，6-二氧嘌呤，化學(xué)式C8H10N402，相對分子質(zhì)量為194.19，易溶于水。溶點(diǎn)為235 ℃～237 ℃，弱堿性，白色結(jié)晶粉末，無臭，味苦，有風(fēng)化性[1]。能溶于水、醇、氯仿、二氯甲烷等溶劑。咖啡因是一種重要的醫(yī)藥工業(yè)原料，具有增加腎臟血流量、強(qiáng)心、利尿、興奮神經(jīng)中樞、消除疲勞等作用，因此，研究茶葉中咖啡因的含量，有助于我們適量飲用，正確、合理利用茶葉的各種保健功能[2]。與常規(guī)提取技術(shù)相比，超聲波輔助提取具有快速、價廉、提取率高等優(yōu)點(diǎn)[3]。針對超聲波特有的能量，作為茶葉樣品咖啡因提取前處理技術(shù)，采用三氯甲烷作為提取溶劑，離心萃取咖啡因，依據(jù)咖啡因在275.0 nm 處有最大吸收，用紫外分光光度計測定茶葉及茶葉制品中咖啡因含量，旨在建立一種測定茶葉及茶葉制品咖啡因含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

茶葉：2011 年昆明市市場隨機(jī)購買，所有茶葉樣品均置于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，粉碎，干燥器內(nèi)保存、備用。

1.2 試劑

三氯甲烷、無水乙醇、二氯甲烷、石油醚：AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑優(yōu)先公司；咖啡因：AR，F(xiàn)ARCO CHEMICAL 提供；亞鐵氰化鉀：AR，天津市化學(xué)試劑三廠；堿式乙酸鉛：AR，天津市化學(xué)試劑三廠。

1.3 儀器

AE-100 電子分析天平：感量為0.000 1 g，梅特勒-托利多中國公司；UV-2401PC 紫外可見分光光度計：日本島津公司；Anke TGL-10B 低速大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；格蘭仕G70F20CN3L-C2HS3120型微波爐：格蘭仕集團(tuán)；超聲清洗器：長沙科美分析儀器有限公司。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品0.050 00 g，用重蒸三氯甲烷溶解并定容至100.0 mL。取上述咖啡因溶液2.5 mL定容到25.0 mL 得到咖啡因工作液，分別取咖啡因工作液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，稀釋并定容至10.0 mL，得到質(zhì)量濃度分別為0.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/mL的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.5 樣品處理

稱取2.0 g（精確到0.000 1 g）粉碎混合均勻過60目篩樣品置于250.0 mL 三角瓶中，加80.0 mL 煮沸蒸餾水浸泡10.0 min 后，將三角瓶放到超聲波清洗器的盛水高度為40 mm 水槽中，超聲15 min 后，轉(zhuǎn)移到100.0 mL容量瓶中，加2.0mL200g/L 的亞鐵氰化鉀溶液和2.0 mL 200 g/L 的堿式乙酸鉛溶液除去茶葉中的蛋白質(zhì)，定容，過濾，濾液超聲脫氣后備用。液體樣品除蛋白，超聲脫氣后備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳提取條件的篩選

2.1.1 單因素試驗

2.1.1.1 提取溶劑

咖啡因是存在于許多天然植物中的一類屬于甲基黃嘌呤的生物堿，它在多種溶劑中的溶解性較好。因此，在茶、咖啡、飲料等體系中萃取咖啡因可用的溶劑種類較多，三氯甲烷、二氯甲烷、石油醚和乙酸乙酯等均可用來萃取水相中的咖啡因[4]。按照1.5 樣品處理步驟，研究無水乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚和乙酸乙酯等溶劑對普洱茶咖啡因含量萃取效率的影響。試驗結(jié)果表明（見表1），幾種溶劑均能準(zhǔn)確分層，但三氯甲烷相對較好，且樣品分層速度快，提取率較大，選擇三氯甲烷作萃取溶劑。

表1 不同提取溶劑對咖啡因測定結(jié)果的影響Table 1 Effect of different extraction solvents on yield of caffeine content in black tea

2.1.1.2 三氯甲烷用量

取1.0 mL 樣液，分別添加5.0、10.0、15.0、20.0 mL三氯甲烷溶液經(jīng)離心萃取后，測定不同用量三氯甲烷對茶葉的咖啡因含量的影響。試驗表明，由圖1 可知：三氯甲烷用量越大，咖啡因含量越高，但三氯甲烷屬有毒污染溶劑，按最少量原則和最佳的溶劑比確保樣液和萃取溶劑能準(zhǔn)確分層，最終選定15.0 mL。

圖1 三氯甲烷用量對紅茶咖啡因測定結(jié)果的影響Fig.1 Effect of chloroform dosage on yield of caffeine content in black tea

2.1.1.3 混配方式

固定其他條件不變，試驗了自動靜止混合、手動混合、微波、離心等混配方式對萃取結(jié)果的影響，結(jié)果見表2。

表2 不同提取方式對紅茶測定咖啡因測定結(jié)果的影響Table 2 Effect of different extraction method on yield of caffeine content in black tea

由試驗結(jié)果可見，離心萃取的測定結(jié)果高于其他幾種混配方式。

2.1.1.4 離心提取速率和時間[6]

研究不同離心速率和時間對萃取結(jié)果的影響，離心速率和離心時間搭配分別為組合（1）：2 000 r/min，20 min；組合（2）：2 500 r/min，15 min；組合（3）：3 000 r/min，10 min；組合（4）：4 000 r/min，15 min。由試驗結(jié)果（圖2）可見，離心速率為3 000 r/min，離心10 min 時咖啡因含量較高。

圖2 離心速率和離心時間對紅茶咖啡因結(jié)果的影響Fig.2 Effect of Centrifugal rate and time on yield of caffeine content in black tea

2.1.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，研究超聲提取時間（A）、三氯甲烷用量（B）、離心萃取速率（C）、離心萃取時間（D）等四因素三水平L9（34）正交試驗，影響因素及水平見表3。

表3 咖啡因含量測定最佳因素水平表L9（34）Table 3 Level and factor of orthogonal test L9（34）

表4 咖啡因含量測定優(yōu)化篩選的試驗方案Table 4 Orthogonal test of detemination caffine

正交試驗結(jié)果表明，取樣量為2.0 g、超聲波水層深度為40 mm 時，最佳的提取條件為：超聲波輔助提取時間15.0 min、每毫升樣液三氯甲烷的用量為5.0 mL，離心萃取速率為2 500 r/min，離心萃取時間15.0 min。影響茶葉中咖啡因提取效果因素的主次順序為：超聲提取時間＞離心萃取時間＞離心萃取速率＞三氯甲烷用量。

2.2 方法的重復(fù)性試驗

分別取普洱茶、綠茶、紅茶飲料、綠茶飲料等樣品，每個樣品測定7 次，計算其標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)。本法的精密度分別為0.15%、0.75%、0.38%和0.88%。

2.3 加標(biāo)精密度試驗

精密稱取已測定咖啡因含量普洱茶的樣品3 份，分別加人低、中、高3 種不同量的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品，按樣品溶液制備方法并進(jìn)行測定，結(jié)果見表5。加標(biāo)回收率在98.56%～100.28%之間，符合分析測試要求。

表5 加標(biāo)回收率試驗Table 5 Test of sandard addition

2.4 本法和標(biāo)準(zhǔn)法差異顯著性比較

選擇紅茶樣品，用本法和標(biāo)準(zhǔn)法分別進(jìn)行7 次平行測定，考察本法的精密度以及與表標(biāo)準(zhǔn)法的分析結(jié)果是否具有同一性。結(jié)果見表6（表中結(jié)果均為7 次測定紅茶樣品的平均值）。

表6 兩種方法的差異顯著性比較[7-8]（t 測試，顯著水平0.05）Table 6 Significant analysis of two methods

由差異顯著性比較結(jié)果可知（見表5）：本法和標(biāo)準(zhǔn)法之間差異的t 值為0.266，小于0.05 水平上的t值，即t=0.319＜t120.05，兩種方法測定結(jié)果差異不顯著，本法和標(biāo)準(zhǔn)法測定茶葉咖啡因含量，其結(jié)果具有同一性。

3 結(jié)論

1）采用超聲波預(yù)處理和離心萃取技術(shù)測定了茶葉及茶葉制品中咖啡因含量，通過單因素試驗和正交試驗，當(dāng)稱樣量為2.0 g、超聲波水層深度為40 mm 時，確定了最佳的提取條件為：超聲波提取時間15 min、三氯甲烷用量為15 mL，離心萃取速率為3 000 r/min，離心萃取時間10 min。萃取到的咖啡因三氯甲烷溶液加入適量的無水硫酸鈉去除樣品中的水分，用紫外分光光度計在275.0 nm 處測定茶葉及茶葉制品中咖啡因含量。

2）通過對法的重復(fù)性和加標(biāo)回收率試驗，結(jié)果表明，本法的精密度和加標(biāo)回收率試驗結(jié)果良好，可以用于茶葉及茶葉制品咖啡因含量的測定。

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