俄羅斯蜜蜂保種群的遺傳標識碼：基因組微衛星標記譜圖

Brandorf A Ivoilova M 李興安 薛運波（ Russian Agricultural Academy North-East Agricultural Research Institute named after N.V.Rudnitsky，Kirov 60007； 吉林省養蜂科學研究所，吉林 308）

俄羅斯遠東地區位于俄羅斯最東部，屬于寒帶氣候，具備原始、完整的植物生態系統，并且擁有山區森林植物種源基地。大約在十九世紀中期，歐洲人在向俄羅斯符拉迪沃斯托克及其周邊海冰邊疆（Coastal Primorski region around Vladivostok，Asian Far East；即，俄羅斯遠東地區）移居時帶入了西方蜜蜂（但是沒有資料顯示引入蜜蜂究竟是哪一個西方蜜蜂亞種或地理生態型）[1]。國內、外相關文獻所描述的俄羅斯蜜蜂（Russia honeybee）就是指分布于這個地區的西方蜜蜂[2-4]。由于這個地區位于東方蜜蜂分布地域的最北端[5]，俄羅斯蜜蜂與當地東方蜜蜂共同形成了同域物種，并且在適應寒冷冬季氣溫和經歷漫長越冬期的基礎之上具備了抗寒特性。雖然東、西方蜜蜂之間存在生殖隔離機制，但是俄羅斯蜜蜂在同當地東方蜜蜂生存競爭中演變成為螨蟲（特別是大滿蟲）的寄生宿主。這可能是低溫馴化（cold acclimation）在長達一百五十多年的進程中，通過誘導蜜蜂行為基因的表達，使俄羅斯蜜蜂進化成為具有抵抗螨蟲侵襲的西方蜜蜂[6-9]。因此，俄羅斯蜜蜂既保留了西方蜜蜂所具有的蜂蜜高產這個農藝性狀，同時獲得了東方蜜蜂所具有的抵御氣候寒冷和螨蟲侵襲的生物學特征。

二十世紀后期，螨蟲侵襲蜜蜂所致的蜂群生產力下降開始成為威脅養蜂生產的主要病蟲害；迄今為止，螨蟲侵襲蜜蜂所致的蜜蜂消失已經成為蜂群崩潰綜合征的一個主要原因[10]。基于上述現狀，各國養蜂研究人員推測俄羅斯蜜蜂可能成為培育抗病蜜蜂的育種素材[11]。1997年，俄羅斯蜜蜂首次被引入美國；2005年，美國通過閉鎖繁育技術體系在中南部和西部建立了多個俄羅斯蜜蜂保種場；2009年，美國俄羅斯蜜蜂保種群供應商協會開始在全國范圍內推廣含有部分俄羅斯蜜蜂血統的商業用種蜂王[12]。盡管通過雜交選育方法生產的雜交種不能夠將目的基因穩定地傳遞給后代，但是那些含有俄羅斯蜜蜂部分血統的商業用種蜂王明顯地表現了抵抗螨蟲侵襲的能力（相對于當地其它商業用種蜂王）[11]。而且，作為俄羅斯蜜蜂保種場建設的一項基礎工作，基因組微衛星標記技術作為一項輔助育種手段被用來診斷俄羅斯蜜蜂保種群[12]。Bourgeois等（2010）通過11對西方蜜蜂基因組微衛星引物引發的體外聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）方法，將引入美國的俄羅斯蜜蜂與當地的非俄羅斯蜜蜂（包括意大利蜜蜂、卡尼額拉蜜蜂、高加索蜜蜂和一些具備抗病性狀的意大利蜜蜂雜交種）鑒別出來。

然而，俄羅斯也是歐洲黑蜂在歐洲的一個主產地[13，14]。現有資料顯示，歐洲黑蜂在歐洲向東方向的地理分布極限地域是位于俄羅斯西部平原（歐洲部分）與東部高原、山地（亞洲部分）之間的烏拉爾山脈，即俄羅斯中部地區[15]。為了初步揭示俄羅斯蜜蜂與歐洲黑蜂之間的遺傳關系，本研究通過聚合酶鏈反應體外擴增基因組微衛星標記的方法，對俄羅斯遠東地區符拉迪沃斯托克及其周邊海冰邊疆采樣點的俄羅斯蜜蜂（俄羅斯當地人稱之為俄羅斯遠東黑蜂）和俄羅斯中部地區烏拉爾山脈采樣點的歐洲黑蜂（俄羅斯當地人稱之為俄羅斯中部蜜蜂）進行了比對分析。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

本研究野外試驗和室內試驗均于2012年6月至12月在俄羅斯國家農業科學院東北科研中心東北區羅德尼茨農業科研所（Russian Agricultural Academy North-East Agricultural Research Institute Named after N.V.Rudnitsky）進行；統計學分析于2013年4月至6月在吉林省養蜂科學研究所進行；雙方共同參與了論文撰寫工作。

1.2 試驗材料

通過選擇采樣方法，分別從俄羅斯遠東地區符拉迪沃斯托克及其周邊海冰邊疆采樣點和俄羅斯中部地區烏拉爾山脈采樣點的蜜蜂保種場各選擇50群蜜蜂，并且從每一群蜜蜂中采集50只體色、大小一致的工蜂，浸泡于盛有無水乙醇或70～75%乙醇溶液的標本瓶。在進行室內試驗時，從每一個標本瓶中選取其中的1～2只蜜蜂，并且記錄為1個實驗樣本。

1.3 試驗方法

1.3.1 分析樣本的制備

這部分操作包括蜜蜂組織的解剖和粉碎2個流程。在生物安全柜工作條件下，從單個蜜蜂個體中分離出頭部、胸部。解剖方法是首先用眼科剪刀將蜜蜂腹部去掉，用紙巾吸干蜜蜂剩余組織內的浸泡液；其次，將蜜蜂組織置于2.0-ml塑料離心管中，在離心管內用眼科剪刀將蜜蜂組織剪成碎屑狀物質，放入4粒鋼珠；最后，將離心管置于-80 ℃冰箱冷凍30 min，從冰箱中取出離心管并且放入組織粉碎儀指定位置，設置粉碎儀的工作參數（頻率為27 HZ，時間為30 s），啟動組織粉碎儀。

1.3.2 分析樣本的消化

待粉碎操作完畢后，取出離心管，放入離心機并且離心（8000 rpm）1 min，在離心管內依次加入1000 μl裂解液（0.03 mol/L 3-羥甲基-氨基甲烷；0.2 mol/L乙二胺四乙酸鈉；0.25 mol/L氯化鈉；0.1%十二烷基硫酸鈉）和20 μl蛋白酶K（10 mg/ml），將離心管放入混勻儀，旋轉混勻（50 rpm）10 min。將離心管插入樣品管消化架，置于水浴鍋（50～55 ℃）消化6～8 h。

1.3.3 基因組的提取

從水浴鍋中取出離心管，放入混勻儀并且旋轉混勻10 min，離心（5000 rpm）10 min，將上清液轉移入另外一個離心管，加入20 μl 核糖核酸酶A（10 mg/ml），將離心管插入樣品管消化架，放入水浴鍋（37 ℃）消化1 h。從水浴鍋中取出離心管，離心（5000 rpm）10 min，將上清液轉移入另外一個離心管，加入等體積苯酚，放入混勻儀，旋轉混勻10 min，離心（8000 rpm）10 min；取上清液并且轉移入另外一個離心管，加入等體積苯酚、氯仿、異戊醇混合液（體積比為25：24：1），放入混勻儀，旋轉混勻10 min，離心（8000 rpm）10 min；取出離心管，取上清液并且轉移入另外一個離心管，加入等體積氯仿、異戊醇（體積比為24：1）混合液，放入混勻儀并且旋轉混勻10 min，離心（8000 rpm）10 min；取出離心管，取上清液并且轉移入另外一個離心管，加入二分之一體積異丙醇，混勻后置于4 ℃冰箱1 h以上。放入離心機，離心（12000 rpm）10min，棄上清液而保留沉淀，加入1 ml 75%乙醇；放入離心機并且離心（12000 rpm）5 min，棄上清液而保留沉淀；放入離心機并且離心（12000 rpm）1 min。用10-μl移液尖吸去沉淀周圍的殘留液體，離心管平放于紙巾上并且暴露2 min，根據沉淀大小在每一離心管內加入10～30 μl T10E1緩沖液（10 mmol/L 3-羥甲基-氨基甲烷，1 mmol/L乙二胺四乙酸鈉），于4 ℃冰箱放置1h以上，待完全溶解后貯存于-40 ℃冰箱。

1.3.4 基因組純度的鑒定

稱取1 μl基因組提取物，加入4 ml去離子水，以等量去離子水為對照，分別在可見光波長為260 nm和280 nm條件下測定光密度值。

1.3.5 基因組濃度的鑒定

稱取1 μl基因組提取物，加入4 ml去離子水，以等量去離子水為對照，在可見光波長為260 nm條件下測定光密度值，以噬菌體λDNA為陽性標準，通過分光光度計的光密度值與濃度值換算程序模塊測定基因組濃度。

1.3.6 基因組完整性的鑒定

稱取2 g瓊脂糖，加入200 ml 1×TBE溶液（0.1 mmol/L 3-羥甲基-氨基甲烷，0.1 mmol/L硼酸，2 mmol/L乙二胺四乙酸鈉），電爐加熱直至溶質完全溶解，加入2 μl溴化已錠溶液（10 mg/ml）并且于室溫放置1 min，待瓊脂糖溶液稍微冷卻后緩慢灌入凝膠制膠板，室溫放置30 min，待瓊脂糖凝固后從凝膠中緩慢拔下梳子，將凝膠放入電泳槽指定位置，加入1×TBE溶液直至液面沒過凝膠表面。分別取1 μl基因組提取物、4 μl T10E1和1 μl 上樣緩沖液[稱取95 g甲酰胺，0.05 g二甲苯青，0.05 g溴酚藍，0.2 ml氫氧化鈉（5 mmol/L），依次放入預先稱取的80 ml去離子水中，放入攪拌仔輔助溶解直至溶質完全溶解，加去離子水直至100 ml，分次轉移入1.5-ml塑料離心管，－20 ℃保存]，并且于1.5-ml離心管內混合，將混合物加入凝膠加樣孔。設定電泳參數（電壓：100伏特，時間：60 min），啟動電泳程序。

1.3.7 擴增基因組微衛星等位序列的引物、PCR反應體系和反應條件

本研究通過參考Bourgeois等的報道借用了其中的PCR擴增基因組微衛星等位序列的引物、反應體系和反應條件[12]。

1.3.8 PCR擴增產物的分離

1.3.8.1 聚丙烯酰胺凝膠的制作

這部分操作包括制備凝膠溶液、安裝凝膠制膠板以及灌注凝膠3個流程。

制備凝膠溶液的操作過程如下：稱取33.6 g尿素，依次加入10 ml 40%聚丙烯儲存液（交聯度為5.5%）、8 ml 10×TBE和20 ml去離子水，放入攪拌仔輔助溶解直至溶質完全溶解。

安裝凝膠制膠板的操作過程如下：將大、小兩塊玻璃板用自來水沖洗干凈，室溫晾干，用95%乙醇徹底擦洗玻璃板工作面（不得遺漏任何殘留物），室溫放置2 min。在5-ml離心管內配制親和硅烷溶液（親和硅烷、冰乙酸和95%乙醇的體積分別為2 μl，10 μl和2000 μl），將其涂布于大玻璃板工作面上，手持單層紙巾，在玻璃板工作面上沿一個方向往返涂抹親和硅烷溶液約1 min（目的是將親和硅烷均勻地覆蓋于大玻璃板的工作面）；將2 ml剝離硅烷涂布于小玻璃板的工作面，手持單層紙巾，在小玻璃板的工作面沿一個方向往返涂抹剝離硅烷約1 min。之后，手持單層紙巾，在大玻璃板的工作面沿一個方向往返涂抹剝離硅烷約1 min（目的是擦掉多余未結合于玻璃板的親和硅烷）；手持單層紙巾，在小玻璃板的工作面沿一個方向往返涂抹剝離硅烷約1 min。上述操作過程大約需要10 min。之后，將2個塑料邊條置于大玻璃板的兩個側邊，將小玻璃板的工作面對準大玻璃板的工作面并且將它們扣合在一起，用醫用膠帶填補大、小玻璃在底部的縫隙，用幾個鐵制夾子固定大、小玻璃的兩個側面，在大、小玻璃板之間的指定位置插人鯊魚齒梳子以確定大、小玻璃板之間的縫隙寬度，待大、小玻璃板之間的縫隙寬度確定之后，暫時取出鯊魚齒梳子。

灌注凝膠的操作過程如下：將溶解的凝膠溶液轉移入一個100-ml量筒，添加去離子水直至80 ml，在短時間內依次加入80 μl四甲基乙二胺和320 μl過硫酸銨（10 mg/ml），將凝膠溶液轉移入一個200-ml三角燒瓶，于靠近大、小玻璃之間安置鯊魚齒梳子的一側，緩慢灌注凝膠溶液，大、小玻璃板與水平支持物之間的傾斜度約為45°（在灌注凝膠溶液過程中不得出現氣泡）。將大、小玻璃板水平放置于支持物上，在大、小玻璃板之間的指定位置插入鯊魚齒梳子，將剩余凝膠溶液添加到鯊魚齒梳子的上表面，用一次性PE手套覆蓋鯊魚齒梳子的上表面，于室溫放置，直至過夜。

1.3.8.2 聚丙烯酰胺凝膠的電泳

這部分操作包括預電泳和電泳2個流程。將凝膠板安裝入電泳槽指定部位，安裝時確保凝膠板大玻璃側面朝向操作者而小玻璃側面背離操作者，在電泳槽上、下端加入1×TBE緩沖液直至凝膠板上、下端的凝膠完全浸入液體中。設置預電泳條件（電位：2000伏，電流：200毫安，功率：80瓦，時間：1 h），啟動預電泳程序，在電泳過程中待凝膠板玻璃面漸漸變熱后暫停預電泳，從凝膠板中拔出鯊魚齒梳子，左手將魚尾式移液尖遠端緩慢伸入凝膠加樣孔，右手將吸耳球插入魚尾式移液尖近端，借此向凝膠加樣孔吹入空氣以去除沉積于凝膠加樣孔的尿素結晶。在PCR產物中加入3 μl上樣緩沖液，混勻后加入凝膠加樣孔。設置電泳條件（電位：2000伏，電流：200毫安，功率：55瓦，時間：1.5 h），啟動電泳程序。

1.3.9 PCR產物的顯影

這部分操作包括凝膠固定、凝膠染色和凝膠顯色3個流程。從電泳槽中取出凝膠板，從凝膠板中取出小玻璃板，將大玻璃板及其所負載的凝膠浸入固定液（10%冰乙酸），振蕩浸泡30 min。從固定液中取出凝膠板，用去離子水清洗凝膠10 min，將凝膠板浸入染色液（稱取2 g硝酸銀和3 ml甲醛，依次放入2000 ml去離子水中，混勻直至溶質完全溶解，－20 ℃預冷1h），振蕩浸泡30 min。從染色液中快速取出凝膠板，短暫地浸入去離子水中（浸泡約10 s），將凝膠板快速浸入顯影液［稱取60 g無水硫酸鈉，放入2000 ml去離子水，混勻直至溶質完全溶解，－20 ℃預冷1 h。在染色前，將3 ml甲醛和400 μl硫代硫酸鈉（10 mg/ml）分別加入顯影液，混勻］，振蕩浸泡直至凝膠中出現清晰的紅棕色條帶，加入適量固定液，終止顯色反應。

2 結果與討論

從生物樣品中制備基因組的前提條件是確保基因組提取具有一定的提取效率，反映基因組提取效率的主要技術指標是測定基因組提取物的基因組純度、濃度和完整性[16]。在本研究中，蜜蜂樣本在實驗之前被浸泡于蛋白質變性劑乙醇或70～75%乙醇溶液中，蜜蜂樣本在浸泡液中伴隨保存時間的延長逐漸從新鮮組織轉變為陳舊組織，蜜蜂樣本在實驗過程中經歷了機械粉碎、苯酚萃取等的劇烈操作，它們通過改變基因組純度、濃度和完整性影響DNA提取效率。蜜蜂基因組純度的鑒定結果顯示，對于每一個蜜蜂樣本的基因組，260 nm光密度值與280 nm光密度值的比值均大于2.0（結果未給出）；基因組濃度的鑒定結果顯示，對于每一個蜜蜂樣本的基因組，DNA在基因組提取物的濃度大于陽性標準噬菌體λDNA的濃度（結果未給出）；基因組完整性的鑒定結果顯示，基因組提取物在1%瓊脂糖凝膠電泳譜圖中表現為單一條帶，它們的位置完全相同并且接近于陽性標準噬菌體λDNA在電泳譜圖中的位置（結果未給出）。這提示，在本研究中，基因組的提取具有高的提取效率。鑒于西方蜜蜂微衛星廣泛地分布于其基因組；而且，在幾個模式昆蟲中它的分布密度最高[17]，因此，在本研究中，建立在上述結果之上的后續研究是可靠的。

5%聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果顯示，對于俄羅斯蜜蜂樣本（和歐洲黑蜂樣本），在A064、K0457B位點（和在UN099位點）出現的不同微衛星等位序列條帶的樣本數量最大，而在K0725、UN333B位點（和在SV220位點）出現的不同微衛星等位序列條帶的樣本數量最少（表1）。盡管如此，絕大多數俄羅斯蜜蜂樣本（和絕大多數歐洲黑蜂樣本）在11個基因組微衛星位點均出現不同微衛星等位序列條帶（表1）。這提示，在本研究中，俄羅斯蜜蜂樣本（和歐洲黑蜂樣本）均在11個基因組微衛星等位序列座位存在微衛星復等位序列。而且，俄羅斯蜜蜂在上述基因組微衛星位點出現的微衛星等位序列條帶數基本上與Bourgeois等（2010）的研究結果相一致[12]。這提示，本研究復制了Bourgeois等的研究結果，這為診斷俄羅斯蜜蜂保種群積累了參考數據。

5%聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果進一步顯示，俄羅斯蜜蜂樣本在11個基因組微衛星位點出現的微衛星等位序列條帶數構成了特有的基因組微衛星標記譜圖，這提示，在本研究中，俄羅斯蜜蜂樣本的基因組微衛星DNA等位序列標記譜圖明顯地不同于歐洲黑蜂樣本的基因組微衛星DNA等位序列標記譜圖。

通過上述分析并且結合Bourgeois等（2010）的研究結果，本文認為，俄羅斯蜜蜂樣本的基因組微衛星DNA等位序列標記譜圖作為俄羅斯蜜蜂保種群的遺傳標識碼，很可能具有特異性（相對于歐洲黑蜂樣本的基因組微衛星DNA等位序列標記譜圖）。

表1 俄羅斯蜜蜂、歐洲黑蜂在11個基因組微衛星等位序列座位的等位序列數統計表

[1] Rinderer TE，de Guzman LI，Kuznetsov V，et al. Resistance to the parasitic mite Varroa destructor in honey bees from far-eastern Russia [J]. Apidologie，2001，32：381-394.

[2] Danka RG，Beaman LD. Flight Activity of USDA-ARS Russian Honey Bees（Hymenoptera：Apidae）During Pollination of Lowbush Blueberries in Maine [J]. Journal of Economic Entomology，2007，100（2）：267-272.

[3] Frake AM，De Guzman LI，Rinderer TE. Comparative Resistance of Russian and Italian Honey Bees（Hymenoptera：Apidae）to Small Hive Beetles（Coleoptera：Nitidulidae）[J]. Journal of Economic Entomology，2009，120（1）：13-19.

[4] Danka RG，Sylvester H A，Boykin D. Environmental influences on flight activity of USDA-ARS Russian and Italian stocks of honey bees（Hymenoptera：Apidae）during almond pollination [J]. Journal of Economic Entomology，2006，99（5）：1565-1570.

[5] Radloff Sarah E，Hepburn C，Hepburn HR，et al. Population structure and classification of Apis cerana [J]. Apidologie，2010，41：589-601.

[6] Vesala L，Salminen TS，Laiho A，et al. Cold tolerance and coldinduced modulation of gene expression in two Drosophila virilis group species with different distributions [J]. Insect Mol Biol，2012，21（1）：107-118

[7] Gregory PG，Evans JD，Rinderer T，et al. Conditional immunegene suppression of honeybees parasitized by Varroa mites [J]. J Insect Sci，2005，5：7.

[8] Schoning C，Gisder S，Geiselhardt S，et al. Evidence for damagedependent hygienic behaviour towards Varroa destructor-parasitised brood in the western honey bee，Apis mellifera [J]. J Exp Biol.2012，215（Pt 2）：264-271.

[9] Le Conte Y，Navajas M. Climate change：impact on honey bee populations and diseases [J]. Rev Sci Tech，08（2）：485-497.

[10] Dainat B，Evans JD，Chen YP，et al. Predictive markers of honey bee colony collapse [J]. PLoS One，2012，7（2）：e32151.

[11] Bourgeois AL，Rinderer TE. Genetic characterization of Russian honey bee stock selected for improved resistance to Varroa destructor [J]. J Econ Entomol. 2009，102（3）：1233-1238.

[12] Bourgeois L，Sheppard WS，Sylvester HA，et al. Genetic stock identification of Russian honey bees [J]. J Econ Entomol，2010，103（3）：917-924.

[13] Miguel I，Iriondo M，Garnery L，et al. Gene flow within the M evolutionary lineage of Apis mellifera：role of the Pyrenees，isolation by distance and post-glacial re-colonization routes in the western Europe [J]. Apidologie，2007，38：141-155.

[14] Meixner MD，Worobik M，Wilde J，et al. Apis mellifera mellifera in eastern Europe-morphometric variation and determination of its range limits [J].Apidologie，2007，38：191-197.

[15] Il'iasov RA，Petukhov AV，Poskriakov AV，et al. Local honeybee（Apis mellifera mellifera L.）populations in the Urals [J].Genetika，2007，43（6）：855-858.

[16] Mygind T，Qstergaard L，Birkelund S，et al. Evaluation of five DNA extraction methods for purification of DNA from atherosclerotic tissue and estimation of prevalence of Chlamydia pneumoniae in tissue from a Danish population undergoing vascular repair [J]. BMC Microbiol，2003，3：19.

[17] 朱玉，薛運波，李興安（通訊作者）.基于基因組微衛星的西方蜜蜂遺傳譜圖和西方蜜蜂地方類群[J].中國蜂業，2012，63（12）：12-16.