蜂膠中總黃酮提取及含量測定的條件研究

王大紅 陳明勝

（1.湖北武漢職業技術學院，武漢 430074；2. 湖北武漢名盛生物科技有限公司，武漢 430022）

蜂膠是蜜蜂從植物芽孢或樹干上采集的樹脂（樹膠），混入其上腭腺、蠟腺的分泌物加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物。經過科學證實，蜂膠含有黃酮類化合物、酸、醇、酚、醛、酯、醚類以及萜烯類、甾類化合物和多種氨基酸、脂肪酸、酶類、維生素、多種微量元素等多種活性成分。近代研究證明，蜂膠所含有的豐富而獨特的生物活性物質，使其具有抗菌、消炎、止癢、抗氧化、增強免疫、降血糖、降血脂、抗腫瘤等多種功能。黃酮類化合物是蜂膠中的主要活性成分，常用醇提法提取。本實驗研究了乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度四個因素對蜂膠總黃酮提取率的影響，然后通過正交試驗研究了蜂膠總黃酮提取的最優工藝條件。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

蜂膠：由武漢名盛生物科技有限公司提供。

1.2 試劑

蘆丁對照品（純度92.5%）、95%乙醇、無水乙醇、10%Al（NO3）3溶液、5%NaNO2溶液、10%NaOH溶液。

1.3 儀器

紫外可見分光光度計、恒溫水浴鍋、抽濾裝置、冷凝回流裝置、電子分析天平、100 ml量筒、50 ml容量瓶、100 ml容量瓶、吸量管、燒杯、鐵架臺。

1.4 實驗方法

1.4.1 蜂膠總黃酮的提取工藝

取3.0 g蜂膠粉，加入75%乙醇水溶液90 ml，在50℃水浴下浸泡提取4 h，浸出蜂膠黃酮后，取出靜置，冷卻后將溶液過濾，濾液備用。

1.4.2 蜂膠提取液中總黃酮含量的測定

準確吸取蜂膠提取液2 ml，稀釋至10 ml，再吸取稀釋液1 ml，置于50 ml容量瓶中，加5%NaNO2溶液2 ml，放置6 min，然后加入10%Al（NO3）3溶液2 ml，放置6 min，再加入10%NaOH溶液12 ml，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min，在508 nm波長處測定吸光度。以蘆丁為標準品測定標準曲線，求回歸方程，計算蜂膠提取液中總黃酮含量。

1.4.3 蜂膠總黃酮提取率的計算

2 結果與討論

2.1 蜂膠總黃酮的測定方法

2.1.1 蘆丁標準溶液的制備

精確稱取蘆丁標準品0.02 g，用少量乙醇溶解后定量轉移到100 ml容量瓶中，用無水乙醇定容，得到濃度為0.185 mg/ml的蘆丁標準使用液，置于棕色瓶中待用。

2.1.2 蘆丁標準溶液最大吸收波長的測定

精確吸取0.185 mg/ml的蘆丁標準使用液12 ml于50 ml容量瓶中，加5%NaNO2溶液2 ml，放置6 min，然后加入10% Al（NO3）3溶液2ml，放置6 min，再加入10%NaOH溶液12 ml，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。以不加蘆丁標準液的空白試劑為參比，在波長480-530 nm范圍內，每隔5 nm測定一次吸光度，在最大吸收峰附近每隔2 nm測定一次吸光度。以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制吸收曲線，如圖1所示。從圖1看出蘆丁標準溶液在508 nm有最大吸光度，所以實驗選擇波長508 nm處進行測定。

圖1 蘆丁標準溶液吸收曲線

2.1.3 標準曲線的繪制

準確吸取0.185 mg/ml的蘆丁標準使用液0.00，4.00、6.00、8.00、10.00、12.00、14.00、16.00 ml，分別置于50 ml容量瓶中，分別加5%NaNO2溶液2 ml，放置6 min，然后加入10%Al（NO3）3溶液2 ml，放置6 min，再加入10%NaOH溶液12 ml，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min，在波長508 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線，如圖2所示。根據測定結果，得到線性回歸方程為：A=12.475X+0.0054，r=0.9992。結果表明在蘆丁濃度在0.0147-0.0592mg/ml范圍內呈良好線性。

圖2 蘆丁標準溶液標準曲線

2.2 不同提取條件對蜂膠中總黃酮提取率的影響

2.2.1 乙醇濃度對蜂膠總黃酮提取率的影響

取3.0 g蜂膠粉末5份，分別加人60%、70%、75%、80%、90%的乙醇水溶液各60ml，在50℃水浴下浸泡提取4h，浸出蜂膠黃酮后，取出靜置，冷卻后將溶液分別過濾，量取濾液體積，測定蜂膠黃酮提取率，如圖3所示。由圖3中可以看出隨著乙醇濃度的增加總黃酮的提取率先增加后減少，因此選擇提取濃度75%-85%為宜。

圖3 乙醇濃度對蜂膠總黃酮提取率的影響

2.2.2 固液比對蜂膠總黃酮提取率的影響

取3.0 g蜂膠粉末5份，分別加入1：20、1：25、1：30、l：35、1：40ml的65%乙醇水溶液，在50 ℃水浴下浸泡提取4h，浸出蜂膠黃酮后，取出靜置，冷卻后將溶液分別過濾，取過濾液量體積后，測定蜂膠黃酮提取率，如圖4所示。由圖4可以看出隨著固液比的增加總黃酮的提取含量先增加后減少，因此選擇固液比1：25-1：37為宜。

2.2.3 溫度對蜂膠總黃酮提取率的影響

取3.0g蜂膠粉末5份，加入65%乙醇水溶液60 ml，分別在30、40、50、60、70℃水浴下浸泡提取4 h，浸出蜂膠黃酮后，取出靜置，冷卻后將溶液分別過濾，取過濾液量體積后測定蜂膠總黃酮提取率，如圖5所示。由圖5可以看出隨著溫度的升高總黃酮的提取量先增加后減少，再增加后減少，因此提取溫度選擇在30-60℃為宜。

圖4 固液比對蜂膠總黃酮提取率的影響

圖5 溫度對蜂膠總黃酮提取率的影響

2.2.4 提取時間對蜂膠總黃酮提取率的影響

取3.0g蜂膠粉末5份，加入65%乙醇水溶液60 ml，在50℃水浴下分別浸泡提取2、3、4、5、6 h，取出靜置，冷卻后將溶液分別過濾，取過濾液量取體積后測定蜂膠總黃酮提取率，如圖6所示。由圖6可以看出隨著時間的增加總黃酮的提取量先增加后減少，再增加后減少，因此提取溫度選擇在3-6 h為宜。

圖6 提取時間對蜂膠總黃酮提取率的影響

2.3 蜂膠總黃酮提取條件的確定

為了確定乙醇浸提法提取蜂膠總黃酮的最佳工藝，設計四因素三水平正交試驗對料液比、提取溫度、提取時間、乙醇濃度4個因素進行考察，根據預試驗的結果確定正交試驗各因素的水平如表1所示。正交試驗結果如表2所示。

表1 乙醇浸提法正交試驗的因素與水平

表2 乙醇浸提法正交試驗的直觀分析結果

由表2可知，各因素對蜂膠總黃酮提取率的影響大小依次為：提取溫度>乙醇濃度>料液比>提取時間。極差分析結果表明，提取溫度對提取率有顯著影響，而提取時間對提取率的影響最不顯著。通過正交試驗的極差分析，得到最佳工藝條件為A2B3C1D1，即料液比1：30、提取溫度50℃、提取時間4h、乙醇濃度75%。在此最佳條件下，蜂膠總黃酮的提取率為27%。

3 結論

本實驗對蜂膠總黃酮提取的工藝條件進行了研究，通過單因素實驗和正交試驗分析，得到蜂膠總黃酮的最佳提取工藝條件為：料液比1：30、提取溫度50℃、提取時間4h、乙醇濃度75%。該工藝方法操作簡單，提取率高，適宜于工業化生產。

[1] 付梅紅等.巴西蜂膠最佳提取工藝研究.時針國醫國藥[J]，2008，19（3）：701～703.

[2] 酈金龍等.蜂膠的研究應用進展.中國食物與營養，2011，17（6）：20～24.