羧甲基槲皮素的體外抑菌活性研究

隋 陽， 郭影坤

（東北制藥集團供銷有限公司， 遼寧 沈陽 110023）

槲皮素(quercetin)是一種天然黃酮類化合物，其化學名為2-(3,4-二羥苯基)-3,5,7-三羥基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。槲皮素據報道還具有抑菌活性[1]但是槲皮素的水溶性差，很難應用于臨床。可通過在槲皮素的結構中引入親水性基團，來增加其溶解性，以便其于吸收，從而增強其藥理作用。為增強其水溶性，現將槲皮素衍生化為3′-羧甲基槲皮素鈉（3′-CMQ-3Na）及 4′-羧甲基槲皮素鈉(4′-CMQ-3Na)，本論文主要考察這兩種水溶性槲皮素的抑菌活性。以便進一步探究這兩種衍生物是否與槲皮素一樣，具有其他多種藥理活性，以便更好的開發、利用槲皮素，使其擁有更好的臨床應用前景。

1 實驗部分

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

中間普氏菌、大腸桿菌O111、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC1.2465、金黃色葡萄球菌(Wright) ATCC 49525;、肺炎克雷伯菌。

1.1.2 供試液的配制

磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制：取8 g 氯化鈉，0.2 g 氯化鉀，2.9 g 十二水合磷酸氫二鈉、0.2 g 磷酸二氫鉀，加入1 000 mL 三蒸水。LB 液體培養基的配制：取10 g 氯化鈉，10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母粉，加入1 000 mL 三蒸水。LB 固體培養基的配制：于上述培養基加入1 000 mL 三蒸水前，加入16 g瓊脂粉，其余步驟相同。CDC 液體培養基的配制：取 5 g 氯化鈉，15 g 胰蛋白胨，5 g 酵母粉，5 g大豆蛋白胨，維生素 K 10 mL,，氯化血紅素 5 mg，400 mg L-半胱氨酸，加入1 000 mL 三蒸水。CDC固體培養基的配制：于上述培養基加入1 000 mL 三蒸水前，加入16 g 瓊脂粉，其余步驟相同。頭孢哌酮鈉溶液的配制：頭孢哌酮鈉粉針劑在每次用前現配。將10 mL 蒸餾水注入1 g 頭孢哌酮鈉中混勻，并用濾膜過濾兩次，藥物濃度為100 mg·mL-1。替硝唑溶液的配制：按說明書配制，并在使用前用濾膜過濾兩次。

1.2 實驗方法

1.2.1 對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌活性

取100 μL 的菌種，接入到LB 培養基中，在37 ℃，160 r·min-1的條件下振搖 24 h。收集細菌，于 4 ℃，6 000 r·min-1條件下離心 10 min，然后棄上清，用PBS 重懸并集于一個EP 管內。將菌液依次稀釋106、107、108、109 倍，分別涂到LB 固體培養板上，倒置于37℃保溫箱內20 h,計數。每個樣品量均為20 mL，將菌液加入到無菌的LB 液體培養基，并用此培養基將經2 次濾膜過濾的3′-羧甲基槲皮素鈉及 4′-羧甲基槲皮素鈉進行稀釋，調整 3′-羧甲基槲皮素鈉濃度至0.05, 0.025, 0.0125 , 0.00625 mg·mL-1，4′-羧甲基槲皮素鈉濃度至 0.2, 0.1 , 0.05 ,0.025 mg·mL-1。同時設置 20 mL 無菌的 LB 為空白；加入了菌液的LB 20 mL 母液為陰性對照（-）；在加入了菌液的LB 中再加入新鮮配制的頭孢哌酮鈉溶液，使頭孢哌酮鈉的終濃度為 1 mg·mL-1，此20 mL母液作為陽性對照（+）。菌液的終濃度均調整為107 cfu?mL-1。每隔4 h 用紫外可見分光光度計測樣品的吸光值，波長為600 nm，連續測2 h[2]。

1.2.2 對金黃色葡萄球菌(Wright)的抑菌活性

取100 μL 的菌種方法同前，調整兩化合物濃度均至 0.2, 0.1 , 0.05 , 0.025 mg?mL-1。同時設置 20 mL無菌的LB 為空白；加入了菌液的LB 20 mL 母液為陰性對照（-）；在加入了菌液的 LB 中再加入新鮮配制的頭孢哌酮鈉溶液，使頭孢哌酮鈉的終濃度為1 mg?mL-1，此 20 mL 母液作為陽性對照（+）。菌液的終濃度均調整為107 cfu·mL-1。每隔4 h 用紫外可見分光光度計測樣品的吸光值，波長為 600 nm,連續測24 h。

1.2.3 對肺炎克雷伯菌的抑菌活性

取100 μL 的菌種方法同前，調整兩化合物濃度均至 0.8, 0.4 , 0.2, 0.1 mg·mL-1。同時設置 20 mL 無菌的LB 為空白；加入了菌液的LB 20 mL 母液為陰性對照（-）；在加入了菌液的 LB 中再加入新鮮配制的頭孢哌酮鈉溶液，使頭孢哌酮鈉的終濃度為 1 mg·mL-1，此 20 mL 母液作為陽性對照（+）。菌液的終濃度均調整為107 cfu·mL-1。每隔4 h 用紫外可見分光光度計測樣品的吸光值，波長為 600 nm,連續測24 h。

1.2.4 對大腸桿菌的抑菌活性

取100 μL 的菌種方法同前，調整兩化合物濃度均至 1.6 , 0.8 , 0.4, 0.2 mg·mL-1。同時設置 20 mL 無菌的LB 為空白；加入了菌液的LB 20 mL 母液為陰性對照（-）；在加入了菌液的 LB 中再加入新鮮配制的頭孢哌酮鈉溶液，使頭孢哌酮鈉的終濃度為 1 mg·mL-1，此 20 mL 母液作為陽性對照（+）。菌液的終濃度均調整為107 cfu·mL-1。每隔4 h 用紫外可見分光光度計測樣品的吸光值，波長為 600 nm,連續測24 h。

1.2.5 對中間普氏菌的抑菌活性

在CDC 血平板上厭氧培養96 h，經鑒定后將數個典型菌落混懸于CDC 液體培養基，于CDC 液體培養基中厭氧培養48 h，用血球計數板計數。用無菌的CDC 液體培養基對經2 次濾膜過濾的3′-羧甲基槲皮素鈉及4′-羧甲基槲皮素鈉進行稀釋，再加中間普氏菌菌液，調整 3′-羧甲基槲皮素鈉及 4′-羧甲基槲皮素鈉終濃度均為 0.2, 0.1, 0.05, 0.025 mg?mL-1。同時設置無菌的CDC 為空白；加入了菌液的 CDC 母液為陰性對照（-）；在加入了菌液的CDC 中再加入配制好的替硝唑溶液，使替硝唑的終濃度為 1 mg?mL-1，此母液作為陽性對照（+）。菌液的終濃度均調整為 107 cfu?mL-1。將青霉素小瓶于37℃、厭氧培養，每隔6 h 用紫外可見分光光度計測樣品的吸光值，波長為620 nm，連續測36 h。

2 結果與討論

2.1 對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌效果

(1) 3′-羧甲基槲皮素鈉對金黃色葡萄球菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強。3′-羧甲基槲皮素鈉對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）為0.05 mg?mL-1，抑菌率（BIR）[3]為98.8%，抑菌效果良好。

(2) 4′-羧甲基槲皮素鈉對金黃色葡萄球菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強。4′-羧甲基槲皮素鈉對金黃色葡萄球菌的 MIC 為0.05 mg?mL-1，BIR 為92.4%，抑菌效果良好。

2.2 對金黃色葡萄球菌(Wright)的抑菌效果

(1) 3′-羧甲基槲皮素鈉對金黃色葡萄球菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強。3′-羧甲基槲皮素鈉對金黃色葡萄球菌的MIC 為0.1 mg?mL-1，BIR 為87.3%，抑菌效果良好。

(2) 4′-羧甲基槲皮素鈉對金黃色葡萄球菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強。4′-羧甲基槲皮素鈉對金黃色葡萄球菌的MIC 為0.1 mg?mL-1，BIR 為78.6%，抑菌效果良好。

2.3 對肺炎克雷伯菌的抑菌效果

(1) 3′-羧甲基槲皮素鈉對肺炎克雷伯菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強。3′-羧甲基槲皮素鈉對肺炎克雷伯菌的 MIC 為 0.8 mg?mL-1，BIR 為83.9%，抑菌效果良好。

(2) 4′-羧甲基槲皮素鈉對肺炎克雷伯菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強。4′-羧甲基槲皮素鈉對肺炎克雷伯菌的 MIC 為 0.8 mg?mL-1，BIR 為 87.5%，抑菌效果良好。

2.4 對大腸桿菌的抑菌效果

(1) 3′-羧甲基槲皮素鈉對大腸桿菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強。3′-羧甲基槲皮素鈉對大腸桿菌的MIC 為1.6 mg?mL-1，BIR為100%，抑菌效果良好。

(2) 4′-羧甲基槲皮素鈉對大腸桿菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強。4′-羧甲基槲皮素鈉對大腸桿菌的MIC 為1.6 mg?mL-1，BIR為97.9%，抑菌效果良好。

2.5 對中間普氏菌的抑菌效果

(1) 3′-羧甲基槲皮素三對中間普氏菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強。3′-羧甲基槲皮素鈉對中間普氏菌的 MIC 為 0.05 mg?mL-1，BIR 為100%，抑菌效果良好。

(2) 4′-羧甲基槲皮素鈉對中間普氏菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強。4′-羧甲基槲皮素鈉對中間普氏菌的 MIC 為 0.05 mg?mL-1， BIR 為 99.8%，抑菌效果良好。

2.6 3′-羧甲基槲皮素鈉及 4′-羧甲基槲皮素鈉的抑菌活性比較

3′-羧甲基槲皮素鈉及 4′-羧甲基槲皮素鈉的抑菌活性比較見表1 和圖1。

表1 3′-羧甲基槲皮素鈉及4′-羧甲基槲皮素鈉的抑菌活性Table 1 Antibacterial activities of 3-carboxymethylquercetin and sodium 4′-carboxymethylquercetin

圖1 3′-羧甲基槲皮素鈉及4′-羧甲基槲皮素鈉對不同細菌的最小抑菌濃度Fig.1 Minimal inhibitory concentrations of 3-carboxymethylquercetin and sodium 4′-carboxymethylquercetin for different bacteria

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、金黃色葡萄球菌(Wright)均為革蘭陽性菌，兩種化合物對其抑菌作用明顯。肺炎克雷伯菌、大腸桿菌均為革蘭陰性菌，兩種化合物對其也具有抑菌作用，但沒有革蘭陽性菌明顯。中間普氏菌也屬于革蘭陰性菌，同時又屬于厭氧菌，兩種化合物對其也具有明顯的抑菌作用。

通過抑菌率的比較進一步說明了 3′-羧甲基槲皮素鈉及4′-羧甲基槲皮素鈉的抑菌作用良好，且對金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)的抑菌作用強于金黃色葡萄球菌(Wright)。同時對既屬于革蘭陰性菌，又屬于厭氧菌的中間普氏菌，也具有非常明顯的抑制作用見圖2。

圖2 3′-羧甲基槲皮素鈉及4′-羧甲基槲皮素鈉在對不同細菌的最小抑菌濃度下的抑菌率Fig.2 Bacterial inhibition rates of 3′-carboxymethylquercetin and sodium 4′-carboxymethylquercetin under the minimum inhibitory concentration for different bacteria

3 結 論

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、金黃色葡萄球菌(Wright)均為革蘭陽性菌，大腸桿菌和肺炎克雷伯菌均為革蘭陰性菌，3′-羧甲基槲皮素鈉及4′-羧甲基槲皮素鈉對革蘭陽性菌抑菌作用明顯優于革蘭陰性菌。并且金黃色葡萄球菌(Wright)比金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的最小抑菌濃度高一倍。這些也為深入研究其作用機制提供了方向。另外，同樣是革蘭陰性菌的大腸桿菌與肺炎克雷伯菌相比，最小抑菌濃度卻要大了一倍，原因可能是人體食用的植物性食物中含有槲皮素，經長期進化，人體內大腸桿菌對槲皮素可能產生了耐藥性，而且大腸桿菌確實存在耐藥性[4]。另外，肺炎克雷伯菌也具有一定的耐藥性[5]，尤其與其他細菌相比，具有略高最小抑菌濃度的肺炎克雷伯菌是否對槲皮素也具有耐藥性仍有待考察。另外，從抑菌率中還發現 3′-羧甲基槲皮素鈉比 4′-羧甲基槲皮素鈉的抑菌效果略好。3′-羧甲基槲皮素鈉及4′-羧甲基槲皮素鈉對革蘭陽性菌如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、金黃色葡萄球菌(Wright)，革蘭陰性菌如肺炎克雷伯菌、大腸桿菌，及其中的厭氧菌如中間普氏菌，均有良好的抑菌作用。結果揭示 3′-羧甲基槲皮素鈉及 4′-羧甲基槲皮素鈉與槲皮素具有類似的抗菌活性，這為進一步探究水溶性槲皮素衍生物的藥理活性提供了可能，也為日后臨床開發槲皮素奠定了一定的基礎。

［1］ 秦曉蓉, 張銘金. 槲皮素抗菌活性的研究[J]. 化學與生物工程,2009, 26 :55-57;78.

［2］ 馬建鳳, 劉華鋼, 朱丹. 中藥體外抑菌研究的方法學進展[J]. 藥物評價研究, 2010,33 (1):42-45

［3］Malkoskim K. A novel antibacterial milk[J]. Antimicrob.Agents Chemother, 2001, 8:2309-2315.

［4］ 張小林,汪復,朱德妹.多重耐藥大腸桿菌中的主動外排機制[J]. 中華傳染病雜志, 1995, 17(2):85-87.

［5］ 陳求剛, 李銀珍, 周文,等. 多重耐藥肺炎克雷伯菌耐藥基因的初步定位研究[J]. 中國熱帶醫學, 2007, 7(03):337-338.