膽汁內、外引流術對梗阻性黃疸大鼠小腸黏膜巨噬細胞和TNF-α表達的影響

趙巖，李聞

（中國人民解放軍總醫院消化科，北京100853）

·論著·

膽汁內、外引流術對梗阻性黃疸大鼠小腸黏膜巨噬細胞和TNF-α表達的影響

趙巖，李聞

（中國人民解放軍總醫院消化科，北京100853）

目的探討膽汁內、外引流術對梗阻性黃疸大鼠腸黏膜巨噬細胞及腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達的影響。方法將60只體重300～350 g的成年健康雄性SD大鼠隨機分為四組：梗阻性黃疸組(OJ)、膽汁外引流組(ED)、膽汁內引流組(ID)及假手術對照組(SH)。于二次術后第7天留取末端回腸標本。應用免疫組化染色測定大鼠腸黏膜CD68及TNF-α表達的變化。結果四組大鼠模型均成功建立。梗黃時大鼠腸黏膜CD68及TNF-α的表達水平較假手術組明顯增強，平均光密度升高[(0.58±0.050)、(0.28±0.034)，P＜0.01；(0.34±0.042)、(0.14± 0.021)，P＜0.01]。黃疸由膽汁內引流術解除后，大鼠腸黏膜CD68的表達與梗阻性黃疸組相比明顯減少，平均光密度降低[(0.49±0.049)，P＜0.05]；黃疸由膽汁外引流術解除后，大鼠腸黏膜CD68表達水平減少，平均光密度降低(0.55±0.076)，與梗黃組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。經膽汁內外引流術解除黃疸后，大鼠腸黏膜TNF-α表達受到抑制，平均光密度均降低[(0.29±0.034)、(0.33±0.030)]，但內引流組較梗黃組差異有顯著統計學意義(P＜0.01)、外引流組差異則無統計學意義(P＞0.05)。結論梗阻性黃疸時腸黏膜免疫屏障受損，巨噬細胞及細胞因子TNF-α分泌紊亂，膽汁內引流術能顯著降低腸黏膜炎癥因子的分泌，但膽汁外引流術卻不能改善這一狀況，提示梗阻性黃疸術前通過膽汁內引流術解除要優于膽汁外引流術。

梗阻性黃疸；膽汁內引流術；膽汁外引流術；腸黏膜；巨噬細胞；腫瘤壞死因子α

梗阻性黃疸是臨床常見病、多發病，目前外科手術是解除梗黃的最有效方法，然而圍手術期多臟器損傷的發生率和病死率并未隨著手術技術的提高而顯著下降，其原因除手術創傷和術后并發癥外，與梗阻性黃疸腸黏膜屏障功能受損細菌移位引發血內毒素血癥緊密相關。但到目前為止，是否選擇手術前解除梗阻在外科手術中的意義仍有爭議，膽汁內外引流術，哪種引流方式更好，迄今仍無統一意見[1-2]。本實驗通過研究膽汁內、外引流術對梗阻性黃疸大鼠小腸黏膜巨噬細胞、腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達的影響，為梗阻性黃疸患者的臨床治療提供更多的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物選擇成年健康SD大鼠60只，雄性，體質量300～350 g，由軍事科學院實驗動物中心提供。

1.2 試劑小鼠抗大鼠CD68抗體(Abcam公司)，兔抗大鼠TNF-α抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，小鼠及兔二步法檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 造模與分組保持環境溫度15℃～20℃的情況下，將大鼠分籠單獨飼養，自由飲食飲水，喂養一周后，隨機分為四組，每組各15只。SH組(假手術對照組)：大鼠開腹分離膽總管但并不結扎，飼養7 d后第二次手術，分離大鼠膽總管但并不引流，再飼養7 d后處死留取末端回腸標本。OJ組(梗阻性黃疸組)：大鼠開腹分離膽總管并結扎切斷，成功建立大鼠梗阻性黃疸的模型，飼養7 d后二次手術，開腹分離膽總管但并不引流，7 d后處死留取標本。ID組(膽汁內引流組)：大鼠梗阻性黃疸模型建立后，飼養7 d行二次手術，將內引流管植入膽總管的末端和十二指腸間，關腹再飼養7 d后處死留取標本。ED組(膽汁外引流組)：梗阻性黃疸模型成功后，飼養7 d二次手術，將外引流管插入膽管末端，由皮下引至體外頸背部并固定，7 d后處死大鼠并留取標本。

1.4 標本留取以3%戊巴比妥鈉(60 mg/kg腹腔內注射)進行大鼠麻醉，開腹取回腸末端全層標本，用冰生理鹽水反復沖洗干凈，10%福爾馬林溶液固定，制成石蠟切塊并切片備用。

1.5 免疫組化檢測腸黏膜CD68及TNF-α的表達將石蠟切片常規脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液(PBS）沖洗3次，然后3%H2O2室溫孵育20 min后，采用高壓鍋水浴進行抗原的修復，自然冷卻，PBS沖洗3次，每次3 min，隨后采用正常山羊血清封閉，室溫孵育30 min后，以PBS代替一抗作為對照，滴加一抗，4℃冰箱過夜；再次PBS溶液沖洗3次，每次3 min，滴加二抗，37℃孵育30 min后，用PBS沖洗3次，每次3 min， DAB顯色，自來水進行沖洗，蘇木素復染，最后常規梯度酒精進行脫水后用常規樹脂封片。結果判斷：CD68免疫反應陽性主要表達在胞漿，TNF-α免疫反應陽性主要表達在細胞胞漿及胞膜。DAB顯色呈棕黃色至深棕黃色顆粒顯示為陽性。

1.6 免疫組化圖像分析將免疫組化切片與圖像分析系統的顯微鏡相連接(400×)，每1℃張切片隨機選擇5個視野，應用Image Pro Plus軟件測量CD68及TNF-α平均光密度值(OD)，最后求其平均值。

1.7 統計學方法實驗數據采用均數±標準差(x-±s)表示，應用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析，采用單因素方差分析進行多組間比較分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠的一般情況結扎切斷大鼠的膽總管后，大鼠全身毛色發黃，大小便發黃，飲食量降低，體重減輕。采用膽汁內引流術解除梗阻后，大鼠飲食及活動增加，體重也顯著增加。大鼠行膽汁外引流術解除梗阻后，可看到大量膽汁經外引流管由頸背部排出，但大鼠飲食及活動無變化，體重不變或降低。假手術對照組大鼠的一般情況無明顯變化。

2.2 各組腸黏膜CD68及TNF-α免疫組化染色結果鏡下CD68胞漿著棕黃色主要分布在小腸黏膜固有層；與SH組比較，OJ組腸黏膜CD68表達明顯增多；而與OJ組比較，ED組及ID組腸黏膜CD68表達均降低，且ID組腸黏膜CD68比ED組降低更加明顯(圖1)。TNF-α免疫反應陽性產物主要分布在腸黏膜的巨噬細胞、漿細胞的細胞漿中。與SH組比較，OJ組腸黏膜TNF-α表達增多；但與OJ組比較，ED組及ID組腸黏膜TNF-α均降低，且ID組降低明顯(圖2)。

圖1 各組腸黏膜CD68表達情況。

圖2 各組小腸黏膜TNF-α表達情況

2.3 各組腸黏膜CD68及TNF-α免疫組化染色結果定量分析梗阻性黃疸形成(OJ組)后，CD68、TNF-α表達與SH組比較均顯著增加(P＜0.01)。通過膽汁內引流術解除黃疸后，大鼠腸黏膜CD68表達與梗阻性黃疸組相比顯著減少(P＜0.05)；行膽汁外引流術解除黃疸后，大鼠腸黏膜CD68受抑制較小，減少程度與梗阻性黃疸組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。通過膽汁內、外引流術解除黃疸，大鼠腸黏膜TNF-α表達均受到抑制，平均光密度均降低，但與梗阻性黃疸組相比內引流顯著降低(P＜0.01)、外引流差異無統計學意義(P＞0.05)。各組小腸黏膜CD68、TNF-α表達情況定量分析見表1。

表1 各組大鼠小腸黏膜CD68及TNF-α表達情況

表1 各組大鼠小腸黏膜CD68及TNF-α表達情況

注：與SH組比較，aP＜0.01(F=13.27)，bP＜0.01(F=24.94)；與OJ組比較，cP＜0.05（F=3.98），dP＜0.01（F=6.24）。

組別SH OJ ID ED TNF-α(μg/L) 0.14±0.021 0.34±0.042b0.29±0.034d0.33±0.030例數15 15 15 15 CD68(個) 0.28±0.034 0.58±0.050a0.49±0.049c0.55±0.076

3 討論

梗阻性黃疸是臨床常見綜合征，雖然外科手術和重癥監護手段不斷提高，但圍手術期并發癥發生率和病死率仍居高不下[3]。這與梗阻性黃疸時肝臟分泌的膽汁不能有效進入腸道發揮生理作用，腸黏膜屏障功能受損，內毒素吸收入血引起腸源性內毒素血癥密切相關。

腸黏膜免疫屏障由腸相關淋巴組織(Gut-associated lymphoid tissue，GALT)和彌散免疫細胞組成。許多研究指出梗阻性黃疸后，腸黏膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平顯著降低[4]，使腸道黏膜清除細菌與內毒素的能力下降，發生細菌移位和內毒素入血；但關于梗阻性黃疸時腸黏膜巨噬細胞及其分泌因子TNF-α的表達變化鮮有報道，亦未見膽汁內外引流術解除梗阻性黃疸對腸黏膜巨噬細胞及細胞因子TNF-α影響的研究。因此本研究主要探討梗阻性黃疸時，腸黏膜巨噬細胞及腫瘤壞死因子α(TNF-α)的變化，及通過膽汁內引流術與外引流術解除梗阻性黃疸后，大鼠腸黏膜巨噬細胞及細胞因子TNF-α的變化，從而探討膽汁內引流術優于膽汁外引流術的作用機制，為梗阻性黃疸患者的臨床治療提供更多理論依據。

腸道巨噬細胞大多數位于腸黏膜固有層，起著抗原呈遞的作用，又具有吞噬細菌的功能，在腸道免疫反應中發揮著重要的作用。同時活化的巨噬細胞可分泌許多細胞因子，主要是腫瘤壞死因子α(TNF-α)，從而激活免疫系統。TNF-α主要由單核-巨噬細胞產生，具有防御和致損傷的雙重作用，可作用于細胞膜受體(TNFR P55和P75)，可誘導細胞凋亡、蛋白激酶激活和核轉錄因子(NF-κB)的激活，從而導致細胞凋亡、炎癥發生和纖維組織增生[5]，可誘導IL-1增加，從而增強巨噬細胞的活性，適量分泌具有防御功能，過度則可損傷腸道黏膜，因而巨噬細胞過度激活、活化時造成細胞因子分泌紊亂，反而會造成腸道黏膜損傷。

在本實驗中，梗阻性黃疸及膽汁內外引流術解除黃疸的模型均由改良的大鼠手術成功建立[6]，四組大鼠腸黏膜巨噬細胞及TNF-α含量的變化均由免疫組化染色的方法定量測定，采用平均光密度值表示巨噬細胞及TNF-α表達的強弱。實驗結果得出，CD68標記的巨噬細胞主要分布在固有層，TNF-α主要分布在炎癥細胞的胞漿。巨噬細胞及腫瘤壞死因子TNF-α在假手術對照組少量表達，梗阻性黃疸形成后，兩者表達均明顯增強，平均光密度值也明顯增高，這與其他一些動物及臨床實驗結果相一致。這些實驗表明：梗阻性黃疸時，盡管細胞免疫功能受損，但血清TNF-α炎癥細胞因子顯著升高[7-10]。梗阻性黃疸由膽汁內引流術解除，大鼠腸黏膜巨噬細胞及TNF-α表達降低，平均光密度值下降，與梗阻性黃疸組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)，但梗阻性黃疸由膽汁外引流術解除，大鼠巨噬細胞及TNF-α表達數量仍較高，與梗阻性黃疸組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，從而進一步證明了膽汁內引流術優于外引流術，此結果與我們以前實驗解除膽道梗阻可降低血液TNF-α水平，并且內引流優于外引流這一結論相似[11]。梗阻性黃疸時，腸黏膜免疫屏障受損，巨噬細胞細胞免疫紊亂，細胞因子TNF-α過度分泌，TNF-α可誘導腸上皮細胞凋亡和非凋亡細胞的緊密連接使蛋白分解和功能改變，從而導致腸上皮通透性增加，同時可下調跨膜緊密連接前衛蛋白的咬合啟動子的表達，導致腸電生理功能發生紊亂[12]，最終使腸道黏膜清除細菌與內毒素能力下降，發生細菌移位和內毒素入學，能加劇梗阻性黃疸術后并發癥的發生。

膽汁內外引流術對梗阻性黃疸大鼠腸黏膜巨噬細胞和腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達抑制程度不同的準確機制尚不清楚。膽汁有助于食物的消化和營養的吸收，與此同時膽汁內的膽鹽可以控制大鼠腸內細菌的繁殖，可以降低腸道內毒素的產生，可以抑制細胞因子的過度分泌，可以有效減少過度的炎癥反應[13]。大鼠的腸肝循環可通過膽汁內引流術恢復，但是膽汁外引流術膽汁由大鼠頸背部流向體外，同時因為體外放置外引流管增加了細菌感染的概率。

綜上所述，本實驗表明梗阻性黃疸時腸黏膜巨噬細胞及TNF-α表達增多，腸黏膜受損，膽汁內引流術可以顯著改善這一狀況，而外引流術卻不能有效降低巨噬細胞及炎癥因子的分泌，進一步支持膽汁內引流術優于膽汁外引流術，為梗阻性黃疸患者的臨床治療提供理論依據。

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Effect of internal and external biliary drainages on macrophages and tumor necrosis factor-α levels of intestinal mucosa in rats with obstructive jaundice.

ZHAO Yan,LI Wen.Department of Gastroenterology and Hepatology,the Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,CHINA

ObjectiveTo explore the effect of internal and external biliary drainages on macrophages and tumor necrosis factor-α(TNF-α)levels of intestinal mucosa in rats with obstructive jaundice.MethodsSixty adult healthy male SD rats with the weight of 300～350 g were randomly divided into four groups:obstructive jaundice group (OJ),external drainage group(ED),internal biliary drainage group(ID)and sham operation group(SH).The ileum tissues were taken on the 7th day after the second surgery.Immunohistochemistry was used to determine the expression change of CD68and TNF-α.ResultsFour groups of rats model were successfully established.Compared with SH group,the levels of CD68and TNF-α in rat intestinal mucosa of OJ group were significantly increased,and the mean optical density was increased[(0.58±0.050)vs(0.28±0.037),P＜0.01;(0.34±0.040)vs(0.14±0.021),P＜0.01].Compared with OJ group,the levels of CD68of the ID group significantly decreased and the mean optical density was significantly decreased[(0.49±0.049),P＜0.05)].Compared with the OJ group,the level of CD68of the ED group,was slightly decreased and the mean optical density was slightly decreased,with no statistically significant difference[(0.55±0.076), P＞0.05].The level of TNF-α in both ID and ED groups was reduced.The mean optical density was decreased[(0.29± 0.034),(0.33±0.030)].There was significant difference between ID group and OJ group(P＜0.01).but there was no significant difference between OJ and ED group(P＞0.05).ConclusionAfter common bile duct ligation,the level of macrophages and tumor necrosis factor-α(TNF-α)in intestinal mucosa are significantly elevated in obstructive jaundice. The level of inflammatory cytokines could be reduced significantly by internal biliary drainage in intestinal mucosa of rats with obstructive jaundice,while external biliary drainage had less effect.Internal biliary drainage could be more efficient than external biliary drainage in the relief of intestinal mucosa injury induced by obstructive jaundice.

Obstructive jaundice;Internal biliary drainage;External drainage;Intestinal mucosa;Macrophages;Tumor necrosis factor-α

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.09.0529

R-322

A

1003—6350(2013)09—1249—04

2013-03-01)

國家自然科學基金（編號：30971355）

李聞。E-mail：liwen2000@yahoo.com