利用纖維素水解液中的纖維二糖發酵制備丁二酸

徐 蓉，奚永蘭，張九花，戴文宇，萬月佳，陳可泉，姜 岷

（南京工業大學生物與制藥工程學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816）

丁二酸又名琥珀酸，是一種重要的碳四平臺化合物，其作為一種重要的化工原料在醫藥、食品以及表面活性劑等行業有著廣泛的用途。傳統的丁二酸生產方法以不可再生的石油資源為原料帶來了高成本、高污染等問題，限制了琥珀酸作為基本化工原料的廣泛應用。而微生物發酵法生產丁二酸具有利用可再生資源、固定溫室氣體CO2等優點，近年來成為國內外研究的熱點，并在菌種選育和發酵培養條件優化等方面取得了重要的進展[1-3]。

目前研究的丁二酸生產菌株主要集中在產琥珀酸放線 桿菌（Actinobacillus succinogenes）[4-5]、產琥珀酸厭氧螺菌（ Anaerobiospirillum succiniproducens ）[6-7]、 產 琥 珀 酸 曼 式 桿 菌（Mannheimia succiniciproducens）[8]、重組大腸桿菌（Escherichia coli）[9]。其中，產琥珀酸防線桿菌是一種從瘤胃中分離、耐滲透壓的兼性厭氧細菌，這種細菌可以高產琥珀酸，而且它可以在厭氧條件下利用和同化多種糖類，如葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、纖維二糖和甘露醇等[10]。產琥珀酸放線桿菌的這一特點，使它能夠利用各種各樣的糖類作為碳源高效生產丁二酸。據報道，一些廢棄的廉價可再生纖維素資源如秸稈[11]、玉米皮[12]、甘蔗渣[13]等經過處理后得到的水解液可作為產琥珀酸放線桿菌生產丁二酸的原料，而這些水解液中往往含有多種糖類，如木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、纖維二糖等，但是很少有研究者去考察產琥珀酸防線桿菌利用二糖生產丁二酸的情況，以及水解液中二糖的存在對菌體利用其它單糖的影響。

纖維素水解液中通常含有纖維二糖，這是一種還原性的二糖，是纖維素的基本組成單位。本文考察了Actinobacillus succinogenes NJ113 利用纖維二糖作為碳源發酵生產丁二酸的能力，并利用纖維素酶酶解甘蔗渣纖維素制備纖維二糖的水解糖液，從而用于考察以纖維二糖為主要糖分的水解糖液作為碳源對菌體發酵生產丁二酸的影響。

1 實驗材料和方法

1.1 原料

甘蔗渣由廣州甘蔗糖業研究所提供。

1.2 生產菌株

Actinobacillus succinogenes NJ113（本實驗室篩選并保存）。

1.3 培養基

1.3.1 種子培養基

葡萄糖10 g/L （分開滅菌），酵母膏5 g/L，玉米漿干粉 2.5 g/L，NaHCO310 g/L，NaH2PO4·2H2O 9.6 g/L，K2HPO4·3H2O 15.5 g/L，NaCl 1 g/L，121 ℃滅菌15 min。

1.3.2 發酵培養基

糖類30～70 g/L（分開滅菌），酵母膏10 g/L，玉米漿干粉7.5 g/L ，乙酸鈉1.36 g/L，K2HPO43 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl20.2 g/L，NaH2PO4·2H2O 1.6 g/L，Na2HPO4·3H2O 0.31 g/L，121 ℃滅菌15 min。

1.4 培養方法

種子培養：將凍存于-70℃冰箱的菌種接種于100 mL 血清瓶培養，裝液量50 mL，接種量3%，于37 ℃、200 r/min 搖床中培養10 h 后作為種子液。

血清瓶培養：100 mL 血清瓶裝液量30 mL，接種量3%，于37 ℃、200 r/min 搖床中培養。

3 L 發酵罐（BioFlo 110 fermentor；New Brunswick Scientific Co.，Edison，N.J.）培養：裝液量1.5 L，接種量6%（體積分數），在37 ℃、攪拌轉速200 r/min、CO2通氣量0.5 L/min、以25%NaCO3為pH 調節劑維持pH 值在6.8。

1.5 制備含大量纖維二糖的纖維素水解液

將一定量的甘蔗渣洗凈、烘干，粉碎后過40目篩，然后用2%稀硫酸121 ℃下酸解2 h，過濾去除液體，洗滌殘渣，殘渣的主要成分即為未能酸解的蔗渣中的纖維素。將殘渣置于3 L 大三角瓶中，加入一定量的水控制固液比為1∶5，pH 值調至5.0，添加液體纖維素酶Celluclast 1.5 L（丹麥諾維信公司）15 U/mg，在50 ℃、150 r/min 下振蕩酶解72 h后，過濾去除殘余固體得水解糖液。

1.6 分析方法

1.6.1 菌體密度的測定

將發酵液用去離子水稀釋適當倍數，使A660值在0.2～0.8 之間，用紫外可見分光光度計（Spectrumlab 752s）測定。菌液濁度OD660=A660×稀釋倍數。

1.6.2 糖類及有機酸含量的測定

蔗渣纖維素水解液中各種糖含量的測定、發酵液中殘糖和有機酸含量的測定采用高效液相色譜法，色譜柱為Aminex HPX-87H 型離子排斥色譜柱（300 mm ×Φ7.8 mm，5 μm），以 0.005 mol/L of H2SO4作為流動相，流速0.6 mL/min-1，進樣體積20 μL，柱溫55 ℃。纖維二糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等利用示差折光檢測器檢測[14]，丁二酸、乙酸等利用紫外檢測器檢測，檢測波長為215 nm。

2 結果與討論

2.1 纖維二糖與纖維素水解液中其它常見碳源發酵情況的比較

纖維素水解液中含有多種糖類，如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、纖維二糖等。本實驗在100 mL 的血清瓶中進行厭氧發酵，分別考察不同碳源（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、纖維二糖）對菌體發酵產丁二酸的影響，設定初始糖濃度為30 g/L，發酵24 h，結果見圖1。

圖1 纖維素水解液中常見糖類作為碳源發酵產丁二酸的結果

由圖1可以看出，對于這4種碳源，Actinobacillus succinogenes NJ113 都有較強的利用能力，丁二酸的產率均達到60%以上。木糖和阿拉伯糖作為碳源時，丁二酸產量分別為18.1 g/L 和19.1 g/L；當葡萄糖和纖維二糖作為碳源時，丁二酸產量分別達到20.49 g/L 和20.67 g/L，明顯優于其它兩種碳源。進行至發酵終點時，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖均完全消耗，但纖維二糖還有少量殘余，而且當纖維二糖作為碳源時，發酵液中的乙酸量較高，丁二酸與乙酸的摩爾比為0.98，而葡萄糖、木糖和阿拉伯糖作為碳源發酵時，丁二酸與乙酸的摩爾比分別為1.19、1.14和1.07。由此可見，纖維二糖可以作為碳源用于丁二酸的生產，但存在一些不足，如菌體不能將碳源完全消耗，且副產物乙酸的量較高。

以前的研究發現，A.succinogenes 利用激酶途徑和PEP-PTS 攝入葡萄糖，而且PEP-PTS 還負責轉運果糖、甘露糖、山梨醇、β-葡萄糖苷（如纖維二糖、熊果苷）等[3，15-16]。細胞外的碳源進入PTS 的糖轉運通道后被磷酸化，與此同時細胞內的一部分磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）轉變為丙酮酸，這導致了C4途徑通量的減少，而C3 途徑的通量增加，進而導致副產物乙酸的增多。因此，在纖維二糖作為碳源發酵生產丁二酸時，可能由于PTS 發揮作用，導致副產物乙酸的量較多，究其原因還需要進一步研究。

2.2 不同濃度的纖維二糖作為碳源對菌體生長及產丁二酸的影響

本實驗在100 mL 的血清瓶中進行厭氧發酵36 h，分別考察不同濃度的纖維二糖（30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L）作為碳源時對菌體的生長及產丁二酸的影響，結果見表1。

由表1 可以看出，當纖維二糖濃度為30 g/L 時，纖維二糖的利用率為95.5%，丁二酸的產率高達72.15%，可見產琥珀酸防線桿菌NJ113 有很強的利用纖維二糖發酵產丁二酸的能力；但隨著纖維二糖濃度的繼續增大，殘糖量不斷增多，OD 值呈現先增加后減少的趨勢；產物丁二酸的濃度也隨著纖維二糖的增加而增多，但產率卻有所降低。當糖濃度為70 g/L 時，糖利用率僅為83.4%，丁二酸濃度為38.91 g/L，產率為66.65%，較30 g/L 時降低了7.6%，此時的收率只有55.59%。由此可知，高濃度的纖維二糖對于菌體生長有一定的抑制，從而導致丁二酸的產量和收率也有明顯的降低。

表1 不同濃度的纖維二糖作為碳源發酵產丁二酸的結果

2.3 纖維二糖作為碳源發酵制備丁二酸

在3 L 發酵罐中考察以纖維二糖作為碳源發酵制備丁二酸的情況。設定初始纖維二糖濃度為35 g/L，厭氧發酵30 h，發酵結果見圖2。

從圖2 可以看出，當發酵進行至4 h 時，菌體生長進入對數期，開始大量消耗纖維二糖，發酵至26 h 時，培養基中的纖維二糖被完全消耗，總的耗糖速率達到1.35 g/h/L，此時丁二酸的濃度為23.51 g/L，產率為67.17%。由此可見，當纖維二糖作為碳源用于產琥珀酸放線桿菌生產丁二酸時，可以獲得較高的丁二酸產率。另外，從發酵結果不難發現，利用纖維二糖作為碳源發酵生產丁二酸時，副產物乙酸的量較高，由圖2 可以看出，發酵至終點時，副產物乙酸的量為12.44 g/L，丁二酸與乙酸的濃度比為1.89，乙酸產量高的原因還需要進一步考察。

圖2 纖維二糖作為碳源發酵產丁二酸的結果

2.4 蔗渣纖維素水解液作為碳源發酵制備丁二酸

在3 L 發酵罐中考察以甘蔗渣纖維素水解液作為碳源發酵產丁二酸的情況。設定初始糖濃度為35 g/L，其中18 g/L 纖維二糖、8 g/L 葡萄糖、5 g/L 阿拉伯糖、4 g/L 木糖，發酵33 h，結果見圖3。

從圖3 可以看出，當發酵進行至9 h 時，菌體密度（OD660）達到最大值9.73，此時培養基中的葡萄糖和木糖全部被消耗，葡萄糖的消耗速率明顯大于木糖的消耗速率，而此時菌體消耗的纖維二糖的量只有2.34 g/L。當發酵進行至16 h 時，阿拉伯糖也被全部消耗，此時發酵液中的所有單糖成分已均被菌體利用。從發酵9 h 至24 h，發酵液中纖維二糖的量快速減少，當發酵進行至33 h 時，剩余4.10 g/L 纖維二糖，丁二酸濃度為20.00 g/L，乙酸13.27 g/L，丁二酸產率64.73%。由此可見，菌體優先利用單糖，且單糖的消耗速率明顯高于纖維二糖的消耗速率。但菌體并非是先將單糖消耗完全后再開始利用纖維二糖，而是二糖的利用要比單糖的利用滯后。另外，到達發酵終點時還有纖維二糖殘留，菌體無法將纖維二糖完全利用，這可能是由于從發酵21 h 開始，菌體進入衰亡期，導致菌體無法繼續利用纖維二糖生產丁二酸。

3 結 論

本文考察了A.succinogenes NJ113 利用纖維二糖發酵產丁二酸的能力，并利用甘蔗渣中的纖維素制備纖維二糖用于發酵生產丁二酸。實驗結果表明：在3 L 發酵罐中，以35 g/L 纖維二糖作為碳源，發酵33 h，丁二酸的濃度達到23.51 g/L，丁二酸產率為67.17%；在3 L 發酵罐中，以蔗渣纖維素水解液作為碳源發酵，初糖濃度為35 g/L（其中纖維二糖18 g/L），發酵33 h，丁二酸產率達到64.73%。因此，A.succinogenes NJ113 有較強的利用纖維二糖的能力，纖維素水解液中的纖維二糖可作為碳源發酵制備丁二酸。

圖3 蔗渣纖維素水解液作為碳源發酵產丁二酸的結果

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