山豬3個候選基因的多態性與繁殖性狀關聯分析

徐小波， 陳 哲， 章熙霞， 袁詠剛， 王 秀， 邢光東， 方津津

(1.江蘇省農業科學院畜牧研究所，江蘇 南京 210014;2.南京市畜牧家禽科學研究所，江蘇 南京 210036)

在養豬業中，繁殖性狀具有重要經濟價值，但繁殖性狀的遺傳力較低，傳統的表型選擇效果不理想，因此國內外學者紛紛轉向尋找與繁殖性狀關聯的基因或者分子標記［1］。目前已經發現幾十個豬繁殖相關數量性狀位點(QTLs)，如雌激素受體(ESR)基因［2］、催乳素受體(PRLR)基因［3］和促卵泡素 β 基因(FSHβ)［4］等，這些基因都不同程度地影響豬的產仔數、產活仔數以及初生質量等繁殖性狀。

ESR、PRLR和 FSHβ基因在民豬、金華豬等地方豬種和長白、大白等國外豬種中都有報道，但尚未見在山豬中的報道。山豬是江蘇省畜禽遺傳資源保護品種，主要分布于寧鎮揚等丘陵山區，具有瘦肉率高、肉質優良、產仔數多、體質好、抗病抗逆性強等優良特性。由于上世紀外來豬種的大力推廣，山豬被人為棄養，目前純種山豬數量較少，盡快挖掘山豬繁殖性狀遺傳優勢并應用于育種工作，已經是迫在眉睫。本試驗研究ESR、PRLR和FSHβ基因多態性對山豬繁殖性狀的效應，以期為山豬的遺傳資源保存和分子標記輔助選育提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗豬群

試驗豬為南京市畜牧家禽研究所試驗豬場山豬育種核心群二胎以上經產母豬60頭，所有種豬均有清晰的系譜和每窩產仔哺育記錄，仔豬斷奶時間為35 d。

1.2 試驗方法

1.2.1 主要試劑 PCR擴增引物合成及DNA測序由英濰捷基(上海)貿易有限公司完成;DNA回收純化試劑盒和小量質粒純化試劑盒均購自天根生化科技有限公司;Premix Ex Taq聚合酶、pMD18-T Vector等均購自大連寶生物公司;限制性內切酶均購自北京NEB公司。

1.2.2 DNA提取 活體采樣，用耳號鉗取耳組織樣約10 mg浸泡在裝有70%乙醇的EP管內，－20℃凍存。采用苯酚法提取DNA。

1.2.3 引物設計 根據參考文獻設計 ESR［5］、PRLR［6］和 FSHβ［4］基因多態位點引物(表 1)經去離子水溶解后，－20℃保存待用。

表1 候選基因引物序列Table 1 Primers designed for candidate genes

1.2.4 PCR擴增體系 PCR反應總體系25.0 μl，Premix Ex Taq 12.5 μl，上、下 游 引 物 (100 μmol/L)各 0.5 μl，模板 DNA 1.0 μl，加滅菌雙蒸水至總反應體積25.0 μl。PCR擴增條件為:94℃預變性5 min;94℃變性 30 s，Tm復性30 s，72℃延伸30 s，35個循環;最后72℃延伸10 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后置于4℃保存。

1.2.5 酶切反應 除FSHβ基因擴增產物直接電泳外，ESR和PRLR基因擴增產物分別用PvuⅡ和AluⅠ限制性內切酶進行酶切。酶切反應體系:2.0 μl 10 ×NEB 緩沖液，0.2 μl 100 ×BSA，0.5 μl內切酶，PCR 產物 5.0 μl，加超純水至 20.0 μl。酶切反應條件37℃，反應時間4～6 h。

1.3 統計分析

利用POPGENE1.32軟件計算基因型和等位基因頻率，并進行哈迪-溫伯格平衡性檢驗。采用統計模型Y=μ+α+e分析基因型對性狀的效應，其中Y為性狀值，μ為總體平均數，α為基因型效應值，e為隨機誤差。

2 結果

2.1 ESR、PRLR和FSHβ基因在山豬中的基因型和等位基因頻率

ESR基因PCR擴增產物片段長度120 bp，酶切后出現多態性(圖1)，出現120 bp條帶的為AA型，出現65 bp和55 bp的為BB型，同時出現120 bp、65 bp和55 bp的為AB型。

圖1 山豬ESR基因PCR-RFLP檢測Fig.1 PCR-RFLP of ESR gene in Shan pig

PRLR基因PCR產物長170 bp，AluⅠ酶切后出現多態性(圖2)，同時出現85 bp、59 bp和19 bp 3條條帶的為AA型，出現104 bp和59 bp的為BB型，同時出現104 bp、85 bp、59 bp和19 bp 4條條帶的為AB型。

圖2 山豬PRLR基因PCR-RFLP檢測Fig.2 PCR-RFLP of PRLR gene in Shan pig

FSHβ基因是由于插入了一個長度為292 bp的逆轉座子造成該基因位點的多態性，PCR產物只出現500 bp條帶的為AA型，只出現220 bp的為BB型，同時出現500 bp和220 bp的AB型(圖3)。

圖3 山豬FSHβ基因PCR電泳檢測Fig.3 PCR of FSHβ gene in Shan pig

山豬ESR、PRLR和FSHβ基因的基因型和基因頻率分布見表2。經卡方測驗，山豬群體內ESR各基因型分布不符合哈迪-溫伯格平衡(P＜0.05);PRLR各基因型的分布符合哈迪-溫伯格平衡(P＞0.05);FSHβ基因只發現AA型和AB型2種基因型，沒發現BB型，其中AA基因型頻率最高，為0.567，不符合哈迪－溫伯格平衡(P＜0.05)。ESR基因的A等位基因頻率低于B等位基因頻率，FSHβ和PRLR基因的A等位基因頻率均高于B等位基因頻率。

表2 ESR、PRLR和FSHβ基因的基因型頻率和等位基因頻率分布Table 2 Gene and genotype frequencies of ESR，PRLR and FSHβ genes in Shan pig

2.2 ESR、PRLR和FSHβ基因多態性與山豬產仔性能

分別統計ESR、PRLR和FSHβ基因各基因型頭胎和二胎的總產仔數(TNB)和產活仔數(NBA)見表3。ESR基因BB型是產仔性能優勢基因型，BB型個體的頭胎及二胎的TNB和NBA均顯著高于AB型(P＜0.05)和AA型(P＜0.01);AB型的頭胎NBA顯著高于 AA型(P＜0.05)，二胎的 TNB和NBA均顯著高于AA型(P＜0.01)。PRLR基因AA型為有利基因型，其效應為AA＞AB＞BB，AA型和AB型頭胎和二胎的TNB和NBA均極顯著高于BB型(P＜0.01)，AA型和AB型之間差異不顯著(P＞0.05)。FSHβ基因在山豬群體內只有AA型和AB型，AA型頭胎TNB和NBA及二胎NBA均顯著高于AB型(P＜0.05)，AA型二胎TNB極顯著高于AB型(P＜0.01)。

表3 ESR、PRLR和FSHβ基因不同基因型的總產仔數與產活仔數Table 3 Total number of born and number of born alive of pigs with different genotypes of ESR，PRLR and FSHβ genes

2.3 ESR、PRLR和FSHβ基因多態性與仔豬初生質量、斷奶質量的關系

分別統計ESR、PRLR和FSHβ基因各基因型頭胎和二胎產仔的初生質量(BW)和斷奶質量(WW)見表4?？梢姡珽SR基因AA型是仔豬體質量優勢基因型，對BW性狀，其效應排序為AA＞BB＞AB;對WW性狀，其效應排序為AA＞AB＞BB;具體表現為AA型的頭胎和二胎的BW均顯著高于AB和BB型(P＜0.05);AA型的頭胎和二胎的WW顯著高于BB型(P＜0.05)。PRLR基因BB型為仔豬體重優勢基因型，對BW和WW性狀，其效應排序均為BB＞AB＞AA;其中BB型頭胎和二胎仔豬的WW均顯著高于 AA型(P＜0.05)，其余差異不顯著(P＞0.05)。FSHβ基因只有AA型和AB型，AB型頭胎和二胎BW和WW均高于AA型(P＞0.05)。

表4 ESR、PRLR和FSHβ基因不同基因型的初生質量和斷奶質量Table 4 Birth weight and weaning weight of pigs with different genotypes of ESR，PRLR and FSHβ genes

3 討論

3.1 各候選基因多態性及群體遺傳分析

陳克飛等［7］研究發現ESR基因的B等位基因在國內豬種占優勢(0.73)，而國外豬種內A等位基因頻率較高(0.66)。在山豬群體中，本研究得到與以往結論相同的結果。趙要風等［4］在二花臉和香豬內只發現了FSHβ基因的 A等位基因，徐寧迎等［8］在金華豬Ⅰ系內發現 B等位基因頻率極低(0.012)，在Ⅱ系和Ⅲ系內只發現A等位基因。本研究中未發現FSHβ基因的BB基因型，B等位基因頻率為0.22。就PRLR基因而言，本研究所得結果與李婧等［9］的研究結果一致。群體的遺傳平衡檢測結果表明，山豬并未處于穩定遺傳平衡狀態。

3.2 各候選基因多態性與產仔數的相關性

ESR基因是較早發現的豬產仔數性狀主效基因，許多研究認為每個B等位基因對產仔數的效應為0.3 ～1.5 頭/胎［2，10-11］。對地方豬種姜曲豬、小梅山豬及二花臉豬的研究發現，ESR基因對總產仔數和產活仔數的效應均達到極顯著水平，每個B等位基因對總產仔數和產活仔數的加性效應分別為1.52和 1.50頭/胎［10］。本研究中，山豬群體 ESR基因BB型是優勢基因型，B等位基因頻率達到0.817，與大多數國內豬種的報道比較一致［7］。同時本研究發現ESR基因BB基因型個體頭胎和二胎的總產仔數和活仔數均顯著高于AA型個體(P＜0.01)。推測山豬與其他地方豬種一樣有較高的繁殖性能的潛力。

趙要風等［4］提出FSHβ是控制豬產仔性狀主效基因，AA基因型是國內豬種的優勢基因型，可以明顯提高產仔數［4，9，12］，但 Korwin-Kossakowska 等［13］報道中FSHβ基因的作用卻是不顯著的。本研究的山豬群體內，B等位基因頻率很低，和其他國內地方豬種的基因分布趨勢相近［11-12，14］，但本研究發現 AA型的頭胎和二胎的總產仔數和活仔數均略高于AB型，A等位基因是優勢基因。由于本試驗未發現BB型個體，可能由于山豬遺傳資源嚴重流失導致，因此FSHβ基因對山豬繁殖性狀的作用有待后期繼續測定。

國內外不同學者對不同豬種的研究發現PRLR基因與產仔數、產活仔數顯著相關，A等位基因能顯著提高產仔數［15-16］;另一部分研究者則認為BB基因型對豬產仔數更有利［6，17］。前人的研究成果說明PRLR多態性與繁殖性能存在相關性，但其在不同豬種中的多態性與繁殖性狀的關系尚無定論。本研究與李婧等［11］的研究結果一致，PRLR基因的A等位基因為優勢等位基因，AA基因型產仔數和產活仔數均顯著高于BB基因型個體。

3.3 各候選基因多態性與初生質量、斷奶質量的相關性

關于ESR、PRLR和FSHβ基因對仔豬初生質量和斷奶質量的影響，目前還沒有定論。部分研究認為ESR、PRLR和FSHβ基因對仔豬初生質量和斷奶質量沒有顯著影響［18-19］，但是胡雪松等［20］發現，PRLR基因對國內豬種和國外豬種初生質量作用顯著不同。本研究中，PRLR基因對頭胎和二胎仔豬的斷奶質量效應顯著，ESR基因對頭胎、二胎的初生質量和斷奶質量均有顯著影響。謝保勝［21］的研究結果表明，金華豬的產仔數、產活仔數與初生質量呈現極顯著負相關，本研究中，山豬的產仔數、產活仔數與初生質量的遺傳關系也有相似趨勢。這一結果為山豬的分子標記輔助選育過程提供了新的的依據和參考。

繁殖性狀是個數量性狀，受微效多基因調控，同時也受到胎次、管理、營養水平和飼養環境的影響。山豬遺傳資源較為稀少，今后還應該通過擴大樣本的數量做深入的研究，為遺傳效應評價提供更有說服力的依據。因此，目前同時考慮幾個繁殖性狀基因的協同作用進行分子育種也許更為可取。

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