棉花草甘膦抗性基因CP4-EPSPS的初步定位

劉吉燾， 馬曉杰， 狄佳春， 陳旭升

(1.南京農業大學農學院，江蘇 南京 210095;2.江蘇省農業科學院經濟作物研究所/農業部長江下游棉花與油菜重點實驗室，江蘇 南京 210014)

(責任編輯:汪恒英)

棉花是重要的經濟作物，中國是產棉大國，棉農因防除棉田雜草每年都需付出大量的人力與物力。草甘膦是一種性能良好的除草劑，具有廣譜除草和土壤中迅速降解的優點［1-3］，是棉田使用最普遍的除草劑之一。但草甘膦作為除草劑也具有弊端，由于具有廣譜除草，即非選擇性除草的效能，故在殺死雜草的同時也會給棉花帶來傷害。基于此，為了更好地利用草甘膦，抗草甘膦棉花便應運而生。抗草甘膦棉花品種最早出現于1997年，由美國孟山都(Mansanto)公司推出［4］。他們從土壤農桿菌變種CP4中分離到編碼抗草甘膦酶(5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶)的基因，并通過農桿菌介導法轉化珂字棉312(Coker312)，把該基因導入棉花植株，從而使棉花對草甘膦產生抗性［5］。種植抗草甘膦棉花，極大地提高了棉田化學除草的靈活性和機動性，噴藥時間不受土壤濕度和天氣情況的限制，雜草隨時可治。

本試驗所采用的抗草甘膦品系G-6是江蘇省農業科學院棉花遺傳育種項目組從種質系PE-14中篩選純化而來［6］，經劉新民等［7］分子鑒定，確定其基因來源為人工合成的抗草甘膦基因CP4-EPSPS。本研究通過SSR分子標記技術對抗性基因CP4-EPSPS進行定位，確定抗性基因的位置，旨在為下一步的基因精細定位，進而深入了解外源基因在染色體中的插入位點機理提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為抗草甘膦的陸地棉G-6和不抗草甘膦的海島棉海7124。

1.2 試驗方法

1.2.1 遺傳群體的構建和形態標記調查 以G-6為母本，海7124為父本雜交，收獲 F1種子。種植F1，通過自交獲得F2種子;F1與G-6雜交得 BC1;F1與海7124雜交得BC2。在江蘇省農業科學院實驗基地種植親本和 F1、F2、BC1、BC2群體，種植方式為營養缽育苗移栽，行距為80 cm，株距為40 cm。在大田用0.2%的草甘膦噴灑各群體，調查其抗性株與非抗性株;而后對分離群體進行χ2適合性測驗。1.2.2 棉花總DNA提取與PCR擴增 取親本及F2群體單株幼嫩葉片，DNA提取采用CTAB法［8］。PCR 反應體系為 10.0 μl，包括 20 ng/μl模板 DNA 1.0 μl、2 mmol/L DNTP 1.0 μl、10 × PCR buffer(含mg2+)、10 mmol/L Primer F 0.6 μl、10 mmol/L Primer R 0.6 μl、5 U/μl Taq DNA 聚合酶 0.1 μl、ddH2O 5.7 μl。PCR反應在PTC-200(MJ research)上進行。PCR反應程序為:94℃預變性2 min;94℃變性40 s;56℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環;最后72℃延伸7 min［9-10］。擴增產物在8.0%聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)上電泳。電泳緩沖液為1×TBE，200 V恒壓電泳。電泳結束后，參照張軍等［11］方法進行染色。

1.2.3 抗草甘膦目的基因的分子檢測 利用特異引物F:5'-CCATCCTCTACTGCTTTCCC-3';R:5'-GTCTCACCTTCATCGCCATC-3'［12］進行 PCR 擴增，檢測F2群體中各單株的抗草甘膦目的基因。在恒壓90 V條件下，使用1%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳，最后在熒光燈下觀察目的片段。

1.2.4 差異標記篩選與目的基因定位 在F2群體中隨機選取抗性植株和不抗植株各10株，每單株取等量葉片，將抗性單株和不抗單株的葉片分別混合，提取總DNA作為近等基因池［13］。利用本實驗室前期從1 350對引物中篩選獲得的分布于棉花26對染色體上的234對SSR核心引物［14］，先篩選F2近等基因混池以及兩親本間的多態性差異標記，而后檢測F2群體共160個單株的基因型。統計多態性條帶，與G-6帶型相同的個體基因記為“1”，與海7124帶型相同的記為“2”，共顯性雜合帶型記為“3”，缺失記為“0”。采用Join Map4.0軟件進行分子標記的連鎖分析和位點排序，確定目的基因在染色體上的位置［15-17］。

2 結果

2.1 抗草甘膦與不抗草甘膦植株的表型特征

草甘膦為內吸傳導型慢性廣譜滅生性除草劑，主要抑制物體內烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶，從而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的轉化，使蛋白質的合成受到干擾導致植物死亡。大田噴施草甘膦后調查發現，噴施草甘膦10 d后，不抗草甘膦植株頂心開始發黑，葉片從邊緣開始枯萎，植株由上至下枯萎直至棉苗整株死亡。而抗性植株則生長正常，沒有出現枯萎枯死等現象。

2.2 抗草甘膦性狀在海陸雜交群體中的分離規律

調查海陸雜交6個世代群體在大田的抗性分離情況，結果見表1，可以看出:陸地棉抗性親本G-6全部表現為抗，海島棉親本海7124全部表現為不抗。雜交F1代均表現為抗;顯性回交群體BC1全部表現為抗;隱性回交群體BC2，其中抗株:不抗株符合1∶1的分離比例;F2代中的抗株:不抗株符合3∶1的分離比例。以上結果表明，抗草甘膦性狀是由1對顯性基因控制的質量性狀。

表1 G-6和海7124雜交后代抗性分離情況Table 1 The segregation of glyphosate-resistant trait in offspring of G-6×Hai 7124

同時，利用特異引物對F2定位群體的單株進行抗性基因分子檢測，圖1是F2群體部分單株的分子檢測結果。由圖可見:非抗性單株無PCR擴增條帶;抗性單株出現了PCR擴增條帶，其擴增長度符合引物設計長度398 bp，顯示本研究采用的抗草甘膦棉花品種的抗性基因是人工合成的CP4-EPSPS。

圖1 F2群體部分單株的抗草甘膦基因分子檢測Fig.1 Glyphosate-resistant gene identification of partial plants from F2population

2.3 CP4-EPSPS基因的分子定位

利用234對核心引物，通過對雙親與F2混池進行差異性標記篩選，共得到27對多態性引物。以這27對多態性引物檢測F2作圖群體每個單株的基因型，結果得到5個分子標記與目的基因連鎖。這5個分子標記分別為 NAU5417、NAU1339、BNL3992、BNL2448、NAU2140，它們都為共顯性標記。其中具有代表性SSR引物的PAGE電泳圖見圖2。

圖2 F2作圖群體部分單株的PCR擴增圖譜Fig.2 PCR amplification profile of partial plants from F2population

查閱Guo等［18］公布的棉花遺傳圖譜，顯示上述5對連鎖標記都位于棉花第5染色體上，從而初步推定目的基因CP4-EPSPS在第5染色體上。進一步細篩位于第5染色體上的其他分子標記，共獲得15個分子標記與目的基因連鎖，而位于目的基因兩側的分子標記分別為 BNL2448、NAU2140(圖3)。其中標記BNL2448與目的基因的遺傳距離為7.0 cM，標記NAU2140與目的基因的遺傳距離為16.2 cM，因此將目的基因定位在棉花第5染色體上。

圖3 抗草甘膦基因CP4-EPSPS的連鎖圖Fig.3 The linkage map of glyphosate-resistant gene CP4-EPSPS

3 討論

3.1 抗草甘膦基因CP4-EPSPS定位的意義

轉基因棉花在國內外已得到普遍推廣與應用，但有關外源基因在染色體體上的定位工作鮮見報道。由于海陸雜交F2群體可以獲得比較多的多態性標記［19］，因此本研究采用了G-6與海7124雜交F2群體作為基因定位群體。定位結果發現:在棉花染色體5上共有15個標記與草甘膦抗性基因CP4-EPSPS連鎖，從而推斷目的基因位于第5染色體上。將本研究獲得的連鎖圖譜與Guo等［18］報道的遺傳圖譜進行比較，發現本研究獲得的15對與目的基因連鎖的引物，其中12對引物在染色體上的排序與文獻中完全吻合，但其中有 3對引物(NAU3014、NAU861、NAU5417)的排序與文獻中有所錯位。這可能是本試驗采用的定位群體與Guo等并不完全相同所致。

CP4-EPSPS是人工合成的一種抗草甘膦基因，對于轉基因作物，外源基因在后代中能否穩定遺傳和表達是轉基因工作成敗的關鍵。外源基因的拷貝數多少、整合區域堿基組成以及結構特點等對于基因的穩定表達、抑制基因的沉默發生具有重要的影響［20］。本研究將CP4-EPSPS初步定位在第5染色體上，接下來可對該基因進行精細定位，然后利用Tail-pcr等技術來研究該基因的插入熱點［21］，分析CP4-EPSPS基因的插入位置及周圍堿基的特點，將為下一步探究外源基因在染色體上的定向插入機理奠定基礎。

3.2 抗草甘膦棉花的育種應用

目前，草甘膦仍是全球使用最廣泛的除草劑。該除草劑價格低廉，遇土后迅速分解，無環境污染;但草甘膦對普通棉花具有較強的殺傷作用，在棉花生長期間使用易產生藥害。培育抗草甘膦品種是解決藥害最經濟、最有效的手段［22-23］。G-6對草甘膦的抗性是受1對顯性基因控制的質量性狀，因此可通過傳統的雜交育種手段，將該基因轉育到生產上的主推品種中，培育新一代優質、高產、抗除草劑的棉花新品種。其次，由于該抗性性狀受顯性單基因控制，可將抗除草劑種質系作為雜交配組的父本，配制抗草甘膦雜交棉新組合。通過苗床噴施除草劑即可進行苗床去雜，還可以在苗期快速鑒定雜交棉的制種純度，從而降低群體去雜與雜交制種純度鑒定的成本，顯示其在雜種優勢利用方面具有廣闊的應用前景。

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