慢性睡眠剝奪對CAS大鼠冠狀動脈狹窄程度的影響

彭貴海，黃琪，陳玲玲，張雨馨，王治校，譚利＊

（1.湖北醫藥學院附屬太和醫院心內科，十堰 442000；2.湖北醫藥學院基礎醫學院，十堰 442000）

睡眠是人類生命活動的重要組成部分，對維持個體生存和正常心理、生理節律起著至關重要的作用。慢性睡眠剝奪（chronic sleep deprivation，CSD）指每日睡眠＜5h，持續3個月以上。CSD既是一種慢性應激，也是一種氧化應激，它已成為一個突出的醫療和公共衛生問題［1，2］。冠狀動脈粥樣硬化（coronary atherosclerosis，CAS）是一個動態發展的病理過程，主要表現為冠狀動脈及其分支內膜類脂質沉著、復合糖類積聚，繼而出現纖維組織增生、鈣沉著和動脈中層病變，以及管腔逐漸狹窄。CSD、CAS的研究較多，但將兩者結合起來研究的文獻［3，4］甚少。本實驗利用CSD對CAS模型大鼠實施應激，探討CSD對CAS大鼠冠狀動脈狹窄進展程度的影響及其可能機制，為臨床防治冠心病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

1.1.1 實驗動物 健康Sprage－Dawley（SD）大鼠96只，SPF級，3～4月齡，體質量210～260g，雌雄各半，由湖北醫藥學院實驗動物中心［許可證號：SCXK（鄂）2005－0008］提供。

1.1.2 實驗試劑 Vit D3注射液購自上海通用藥業股份有限公司，膽固醇購自成都科龍化工試劑廠，豬膽鹽購自廣州環凱微生物有限公司，丙基硫氧嘧啶片購自南通精華制藥有限公司，豬油自制。白細胞介素－1β（Interleukin－1β，IL－1β）試劑盒、白細胞介素－6（Interleukin－6，IL－6）試劑盒購自武漢博士德生物化學技術公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組 實驗動物隨機分為4組，正常對照組24只，CSD組24只，CAS模型組24只，CAS合并CSD組24只。4組實驗環境相同，單籠喂養，予燈光模擬黑夜和白天，給予燈光12h／d，在實驗開始后有1w的適應期，均給予正常喂食，讓動物熟悉環境。

1.2.2 CAS動物模型制備［5］CAS組和 CAS合并CSD組喂飼高膽固醇飼料（4%膽固醇、10%豬油、5%白糖、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、80.3%基礎飼料），并在飼養開始時，腹腔注射VitD32 mL／kg（60萬IU／kg）。12w 后，隨機抽取10%大鼠，取冠狀動脈做病理切片，蘇木素－伊紅（HE）染色；光鏡下觀察，有80%大鼠出現典型動脈粥樣硬化斑塊，即表明CAS大鼠模型建立成功。

1.2.3 睡眠剝奪實施［1，2］利用小平臺水環境法，對CSD組和CAS合并CSD組大鼠進行睡眠剝奪。制作30cm×30cm×30cm睡眠剝奪箱，內置一直徑為6cm的小平臺，小平臺周邊注滿水（水溫維持在24℃左右），水面距平臺面約1cm；于小平臺上方14cm處放置籠蓋，上面放置水和食物；大鼠在小平臺上可以自由飼食飲水，但只能在小平臺上屈曲而立；若睡眠則因伴隨全身肌肉松弛和節律性垂頭，大鼠落入水中而驚醒，再爬上站臺。用此方法，1d實施20h、持續剝奪大鼠睡眠12w。與此同時，為排除隔離、限制活動和水環境造成的應激影響，我們為正常對照組、CAS模型組設立了大平臺，其直徑為18cm，大鼠在平臺上可以睡眠，其他環境與CSD組和CAS合并CSD組相同。每天換水并打掃實驗箱。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 曠場實驗（open field test，OFT）［4］睡眠剝奪12w后，實施OFT，觀察4組大鼠跨格次數（三爪以上跨入鄰格的次數）、直立次數（兩前肢離地1cm以上的次數或理毛的次數）以及排便量（以曠場試驗結束后排便的顆粒數來表示）。

1.3.2 檢測血清致炎因子 睡眠剝奪12w后，將4組大鼠麻醉，開胸于右心室，插管取血6mL，放入預先加入抗氧化劑的試管中，搖勻，靜置30min后，3 000rpm離心10min（SIGMA離心機，離心半徑13.5cm，1 358.37g），取血清，放入－20℃冰箱保存待測。采用放射免疫法、GC－1500型γ放射免疫計數器以及相關試劑盒檢測血清致炎因子，嚴格按照試劑盒說明操作。

1.3.3 病理學檢查 睡眠剝奪12w后，取4組大鼠冠狀動脈做病理切片，HE染色，觀察典型動脈粥樣硬化斑塊以及管腔狹窄程度的變化。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行統計學分析，計數資料采用χ2檢驗，計量資料統計描述用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗處理或進行方差分析，檢驗水準α＝0.05。

2 結果

2.1 4組大鼠在OFT中情感行為變化

與正常對照組比較，CAS模型組跨格次數、直立次數及糞便粒數明顯增多（P＜0.05）；與CAS模型組比較，CAS合并CSD組亦明顯增多（P＜0.05）；CSD組多于正常對照組，少于CAS模型組（P＜0.05）（見表1）。

表1 4組大鼠曠場實驗得分比較（±s）

表1 4組大鼠曠場實驗得分比較（±s）

與CAS模型組比較，＊P＜0.05

?

2.2 4組大鼠血清致炎因子檢測結果

與正常對照組比較，CAS模型組IL－1β（ng／L）、IL－6（pg／mL）水平明顯增高（P＜0.05）；與CAS模型組比較，CAS合并CSD組亦明顯增高（P＜0.05）；CSD組高于正常對照組，低于CAS模型組（P＜0.05）（見表2）。

表2 4組大鼠血清致炎因子水平比較（±s）

表2 4組大鼠血清致炎因子水平比較（±s）

與CAS模型組比較，＊P＜0.05

?

2.3 4組大鼠病理學檢查結果

與正常對照組比較，CAS模型組CAS斑塊出現率、冠狀動脈狹窄程度明顯升高（P＜0.01）；與CAS模型組比較，CAS合并CSD組亦明顯升高（P＜0.05）；CSD組高于正常對照組，低于CAS模型組（P＜0.05）（見表3）。

3 討論

CHD是一種生活方式病，其發生、發展和轉歸與其個體的生活習性密切相關。本研究結果顯示，與CAS模型組比較，CAS合并CSD組跨格次數、直立次數及糞便粒數明顯增多。這一結果說明CAS模型組大鼠處于較高狀態的焦慮水平，CSD進一步加重了CAS大鼠的焦慮行為。

表3 4組大鼠病理學檢查結果比較（±s）

表3 4組大鼠病理學檢查結果比較（±s）

與CAS模型組比較，＊P＜0.05

?

本研究結果顯示，CAS合并CSD組IL－1β、IL－6水平明顯高于CAS模型組。此結果表明CAS模型組大鼠血清IL－1β、IL－6水平較高，CSD應激進一步促進血清IL－1β、IL－6濃度升高。血清IL－1β、IL－6水平升高，可能通過以下途徑參與冠心病的發生發展［6］：1）刺激其他粘附分子（如ICAM－1、VCAM－1）及其它細胞因子的表達，促進炎癥反應；2）刺激肝臟產生CRP急性炎癥因子，促進血栓形成；3）以自分泌的方式刺激血管平滑肌細胞增生；4）炎癥反應發生時，促進巨噬細胞表面低密度脂蛋白膽固醇（LDL）受體的合成及巨噬細胞對LDL的作用，從而加速脂質的沉積及粥樣硬化斑塊的形成等。IL－1β、IL－6是主要的致炎刺激因子，是心血管疾病的重要危險因素，在心血管疾病的發生、發展及預測方面具有重要意義［7］。

本研究病理學檢查結果顯示，CAS合并CSD組CAS斑塊出現率、冠狀動脈平均狹窄程度明顯高于CAS模型組。因此，CSD可以通過刺激大鼠焦慮狀態、致炎因子的產生促進CAS斑塊形成，從而加快冠狀動脈狹窄進展程度，提示我們要把“穩定患者正常睡眠”作為冠心病防治的常規手段來實施［8］。

［1］李娜，趙興蓉，龔雪梅，等.慢性應激對大鼠冠狀動脈粥樣硬化病變及相關因素的影響［J］.中國動脈硬化雜志，2008，16（6）：449－452.

［2］徐鋒，李結華，唐海沁，等.冠心病患者抑郁焦慮狀況及治療進展［J］.臨床醫學，2012，32（6）：110－112.

［3］藥紅梅，呂吉元.PM2.5不同成分致冠狀動脈粥樣硬化大鼠炎癥作用的探討［J］.環境與職業醫學，2010，27（11）：673－676.

［4］李志尚，潘宗奇，陳伯鈞，等.焦慮情緒大鼠血脂水平分析［J］.廣東醫學，2010，31（10）：1251－1253.

［5］陳長香，李建民，李淑杏，等.睡眠剝奪對大鼠海馬區c－fos和IL－1β表達影響［J］.中國公共衛生，2011，27（10）：1314－1315.

［6］張亞晶.睡眠剝奪對大鼠心臟的影響及其機制研究［D］.北京：軍醫進修學院，2009.

［7］方舟.睡眠剝奪對心臟部分功能的影響和機制研究及其藥物干預［D］.北京：軍醫進修學院，2011.

［8］白婧.部隊戰士24小時睡眠剝奪后心率變異、血壓及血清內分泌激素水平變化［D］.北京：軍醫進修學院，2012.