外界因素對松針中多酚、柚皮素含量的影響1）

鄧浩，高波，王文芝，盧衛(wèi)紅＊，王振宇

（1.哈爾濱工業(yè)大學 極端環(huán)境營養(yǎng)與防護研究所，哈爾濱工業(yè)大學 食品科學與工程學院，哈爾濱 150090；2.黑龍江中醫(yī)藥大學 附屬第二醫(yī)院）

近年來研究發(fā)現(xiàn)松科植物的體內(nèi)含有大量的多酚類化合物，具有一系列獨特的化學性質(zhì)和生物活性，統(tǒng)稱為松多酚。該類化合物具有抗氧化、清除體內(nèi)自由基、降血脂、吸收紫外線、抗癌抗腫瘤、消毒殺菌、除臭等多種生理活性；能與蛋白質(zhì)、生物堿、多糖結(jié)合，并可與多種金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，多酚中含有酚羥基等多種官能團，可以通過氫鍵、疏水鍵或者共價鍵與高分子化合物接枝、共聚或共混，可以制備出一系列新型先進材料，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、皮革、化妝品、保健品及高分子材料等領(lǐng)域。柚皮素是柚皮甙的甙元，屬于二氫黃酮類化合物。黃酮類化合物的母核結(jié)構(gòu)相似，多數(shù)成分脂溶性和水溶性不甚理想，生物利用度低。柚皮素具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化、止咳祛痰、降血脂、抗癌抗腫瘤、解痙和利膽、預(yù)防和治療肝病、抑制血小板凝結(jié)、抗粥樣動脈硬化等作用，可被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。

植物多酚生物合成的起始底物為香豆酰－CoA和丙二酰－CoA，而香豆酰－CoA來源于苯丙烷類代謝途徑，丙二酰－CoA來源于乙酰－CoA。它們在查爾酮合成酶（CHS）作用下形成查爾酮，由查爾酮異構(gòu)酶催化查爾酮形成柚皮素，柚皮素作為主要代謝產(chǎn)物分三個途徑合成多酚類物質(zhì)。柚皮素作為多酚合成的必需中間產(chǎn)物，對多酚的合成具有重要的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于探究光照對松多酚和柚皮素含量影響實驗樣本采集于哈爾濱工業(yè)大學二校區(qū)內(nèi)。從不同松樹的不同位置剪取松針，并標記為底部陽面、底部陰面、中部陽面、中部陰面。

用于探究營養(yǎng)、激素對松多酚和柚皮素含量影響實驗樣本采集于實驗室土培松樹苗。營養(yǎng)條件：大量元素包括硝酸鉀3g、硝酸鈣5g、硫酸鎂3g、磷酸銨2g、硫酸鉀1g、磷酸二氫鉀1g。微量元素乙二胺四乙酸二鈉100mg、硫酸亞鐵75mg、硼酸30mg、硫酸錳20mg、硫酸鋅5mg、硫酸銅1mg、鉬酸銨2mg。分別配置成6、8、10、12L的營養(yǎng)液。標號為營養(yǎng)1、營養(yǎng)2、營養(yǎng)3、營養(yǎng)4。分別澆灌不同組的土培松針，每次100mL，每3天一次。激素條件：稱量適量的生長激素（萘乙酸），配置成濃度為20、40、60、80mg／L的溶液。噴灑到生長激素組的松針上，每次10mL，每3天一次。分別標號為激素1、激素2、激素3、激素4。

1.2 實驗儀器

SPECORD200紫外可見分光光度計（成都貝斯達儀器有限公司）；R－1002旋轉(zhuǎn)蒸餾儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；FW100高速萬能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；LDZ5－2離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；SHB循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 沒食子酸標準曲線的制定

準確最取標樣沒食子酸溶液（100μg／mL）0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35mL 于10mL 比色管中，加蒸餾水至2mL，搖勻后加1.0mL福林試劑，4min后加入1.0mL 10%的碳酸鈉溶液，75℃水浴下保持15min后測定溶液在765nm處的吸光值。獲得標準曲線。標準曲線方程為：

Y ＝0.1704 X －0.042，R2＝0.9996。

1.3.2 柚皮素標準曲線的制定

準確稱取0.005g柚皮素標準品，用95%乙醇溶解定容至50mL。分別精密吸取該溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL 于7個10mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，然后在最大吸收波長下以95%乙醇為參比測定各標準稀釋液在290nm處的吸光度，繪制標準曲線。計算回歸方程：

Y ＝0.0551 X ＋0.033，R2＝0.9994。

1.3.3 樣品前期處理

從松枝上采取松針，用剪刀將松針剪細后置于干燥皿中，并做好標記，進行冷凍干燥，直至樣品完全干燥后取出，在室溫下放置30min后用粉碎機將松針粉碎成粉末，用篩子將粉篩出，備用。

1.3.4 松多酚含量的測定

稱量各樣本粉末2g，取兩份，放入250mL三角瓶中，加入250mL 65%的乙醇，超聲輔助提取松多酚和柚皮素。參數(shù)設(shè)置：提取溫度75℃；提取時間45min。將提取液抽濾定容至250mL，取1mL抽濾液，于10mL比色管中，用65%乙醇定容至刻度，準確吸取1mL的松針提取液于10mL比色管中，加蒸餾水至總體積為2mL。加入1.0mL福林試劑后搖勻，4min后加入1.0mL碳酸鈉溶液，25℃水浴下保持2h（75℃水浴15min）后測定溶液在765 nm處的吸光度值。將吸光度值代入沒食子酸標準曲線方程計算出所測溶液中多酚的濃度，然后算出樣品中多酚類成分含量。

1.3.5 柚皮素含量的測定

將超聲輔助提取的松針粉末溶液抽濾，得到上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將獲得的上清液旋蒸干，得到固體粉末。利用95%的乙醇溶液將固體粉末溶解，裝入10mL離心管中，然后進行離心（3500r／min，15min）。離心后記錄所得柚皮素溶液的體積。將得到的柚皮素溶液用95%的乙醇溶液稀釋一定的倍數(shù)，以95%的乙醇溶液為參照，測定各樣本稀釋液在290nm處的吸光度。將測得的吸光度值代入柚皮素標準曲線方程，得到柚皮素稀釋溶液的濃度，最后計算出各樣本中柚皮素的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時期光照對松多酚、柚皮素含量的影響

將松針從松樹的不同部位上采集下來，進行前期處理后，測定各樣本中松多酚和柚皮素的含量。不同時期樣本中松多酚和柚皮素含量測定結(jié)果平均值列于表1中。

表1 松針中松多酚和柚皮素的含量

根據(jù)表1數(shù)據(jù)，對不同時期樹1和樹2中松多酚含量，作出假設(shè)檢驗，經(jīng)t檢驗，P＜0.05，差異顯著。隨著時間的推移，光照時間延長，光照強度增加，松針中多酚的含量逐漸增加，松針中松多酚含量最高值達到43.06mg／g。說明光照對松多酚的合成具有促進作用。

對不同時期柚皮素含量作出假設(shè)檢驗，經(jīng)t檢驗，P＞0.05，差異不顯著。隨著時間的推移，松針中柚皮素含量變化不顯著。柚皮素是多酚合成的中間產(chǎn)物，由于光照促進了多酚的合成，說明光照能促進柚皮素的合成。柚皮素含量沒有增加的可能原因是：光照同時能促進柚皮素參與新陳代謝，使部分柚皮素消耗。

2.2 營養(yǎng)和激素對松多酚、柚皮素含量的影響

購買土培松針苗，在不同營養(yǎng)和激素條件下培養(yǎng)，其他外界條件保持一致。培養(yǎng)1個月后，從松樹苗上采集松針，進行前期處理后，測定松針中多酚和柚皮素的含量。實驗測得結(jié)果平均值列于表2中。

表2 松針中松多酚和柚皮素含量

根據(jù)表2數(shù)據(jù)，在營養(yǎng)實驗組中：對松針中多酚含量作出假設(shè)檢驗，經(jīng)t檢驗，P＜0.05，差異顯著。在一定營養(yǎng)濃度范圍內(nèi)，隨著營養(yǎng)液濃度的上升，松針中松多酚含量明顯增加，松多酚含量最高值為42.21mg／g，說明營養(yǎng)對松多酚的合成具有促進作用。對松針中柚皮素含量作出假設(shè)檢驗，經(jīng)t檢驗，P＞0.05，差異不顯著。

在生長激素實驗組中：各樣本中松多酚含量，經(jīng)t檢驗，P＜0.05，差異顯著。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著噴灑的生長激素（萘乙酸）濃度的增加，松針的生長速度加快，松針中松多酚的含量增加，最高含量為44.35mg／g。說明生長激素對多酚的合成具有促進作用。松針中柚皮素含量經(jīng)t檢驗，P＞0.05，差異不顯著。

3 結(jié)論

本論文研究了不同外界因素對松針中松多酚、柚皮素含量的影響，通過利用比色法測定不同外界條件培養(yǎng)的松針中松多酚和柚皮素的含量。得到的主要結(jié)論如下：

3.1 隨著時間的推移，光照時間延長，光照強度增加，松針中多酚的含量逐漸增加。說明光照對松多酚的合成具有促進作用。但松針中柚皮素含量變化不顯著。說明光照能促進柚皮素的合成，但同時光照也促進柚皮素的新陳代謝，使部分柚皮素消耗。

3.2 用不同濃度的營養(yǎng)液澆灌松針，發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)，隨著營養(yǎng)液濃度的上升，松針中的松多酚含量明顯增加，說明營養(yǎng)能促進松多酚的合成。隨著營養(yǎng)液濃度的上升，松針中柚皮素含量變化不明顯。

3.3 使用不同濃度的生長激素（萘乙酸）噴灑松樹苗，發(fā)現(xiàn)松針的生長速度加快。在一定生長激素濃度范圍內(nèi)，隨著生長激素濃度上升，松針中松多酚含量增加，說明生長激素能促進松多酚的合成。在一定生長激素濃度范圍內(nèi)，隨生長激素濃度上升，松針中柚皮素含量增加，當達到一定濃度時，松針中的柚皮素含量反而降低，當生長激素濃度為80mg／L時，松針中柚皮素含量最高。

［1］程水源，顧曼如，束懷瑞.銀杏葉黃酮研究進展［J］.林業(yè)科學，2000，36（6）：110－115.

［2］Takeuchi A，Matsumoto S，Hayatsu M.Effects of shadingtreatment on the expression of the genes for chalcone synthase and phenylalanine ammonia2lyase in tea p lant（Camellia sinensis）.B ulletin of the National Research Institute ofVegetable，O rnamental Plants and Tea，1995，B（8）：129.

［3］Hefeng Pan，Lennart N.Lundgren.PhenolicsFrom Inner Bark of PinusSylvestris［J］.Phytochemistry，1996，42：1185－1189.

［4］Lynnette R.Ferguson.Role of plant polyphenols in genomic stability［J］.Mutation Research，2001，475：89－111.

［5］Mara E.M.Braga，Rosa M.S.Santos，Inês J.Seabra.Fractioned SFE of antioxidants from maritime pine bark［J］.J.of Supercritical Fluids，2008，47：37－48.

［6］Anna Soko?－?e towska，Jan Oszmianski， Aneta Wojdy?o.Antioxidant activity of the phenolic compounds of hawthorn，pine and skullcap［J］.Food Chemistry，2007，103：853－859.

［7］A.M.Freitas，M.T.R.Almeida and C.R.Andrighetti－Fr?hner，et al. Antiviral activity－guided fractionation from Araucaria angustifolia leaves extract［J］.Journal of Ethnopharmacology，2009，126：512－517.

［8］Galati，E.M.Monforte，M.T.Kirijavanein，S.Forestieri，A.M.Trovato，A.Tripodo，M.M.ⅡFarmaco.1994，49：709－714.

［9］Kroyer G.Zeitschrift fur Eranhrungswissenschaft，1986，25：63－69.

［10］彭述輝，黃泳梅，劉勝龍，等.梁平柚皮抗氧化作用的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2006，34（1）：3－8.

［11］張海德，何繼芹，楊曉泉.柚皮提取物的降血脂和抑腫瘤作用［J］.食品科學，2005，26（s1）：73－76.

［12］王順祥，魏經(jīng)建，高其鑫，等.消癌靈對荷瘤小鼠胸腺及超氧化物歧化酶活性的影響［J］.中國冶金工業(yè)醫(yī)學雜志，1995，12（3）：129－131.

［13］Bors W，Michel C，Stettmaier K Electron paramagnetic resonance studies of radical species of proanthocyanidins and gallate esters［J］.Arch BiochemBio－phys，2000，374：347－355.

［14］Cowan MM Plant products as antimicrobial agents［J］.ClinMicrobiol Rev，1999，12：564－582.

［15］Santos－Buelga C，Scalbert A Proanthocyanidins and tanninlike compounds：nature，occurrence，dietary intake，and effects on nutrition and health［J］.J Sci Food Agric，2000，80：1094－1117.

［16］Arrabal C，cortijo M，Simon B F，et a1.Differentiation among five Spanish PinusPinaster Provenance based on its oleoresin terpenic composition［J］.Biochemical.Systematics and Ecology，2005，33：1007－1016.

［17］Rune Slimestad，Andrew Marston，Kurt Hostettmann.Preparative separation of phenolic compounds from Piceaabies by high－speed counter－current chromatography［J］.Journal of Chromatography A，1996，719：438－443.

［18］Vincent Dellus，Isabelle Mila，AuwstixScalbert，et al.Douglas－fir Polyphenols and Heartwood Formation［J］.Phytochemistry，1997，45：1573－1578.