米根霉Fp-6 利用紅薯發酵生產L-乳酸

黃筱萍，黃國昌，印培民

(江西省科學院微生物研究所，江西 南昌，330029)

乳酸是世界上三大有機酸之一，在化工、醫藥、食品加工等領域有著廣泛的用途。目前，工業化生產L-乳酸多發玉米、大米和木薯淀粉糖為原料。隨著糧食來源食物作物的淀粉糖價格不斷攀升，乳酸發酵工業的利潤逐漸降低，因此開發低成本發酵工藝，尤其是采用各種廉價非糧生物質原料進行發酵生產是降低乳酸生產成本，促進聚乳酸產業快速發展的重要技術趨勢。

目前國內外尚未見有關以紅薯為原料進行L-乳酸發酵的報道，主要以細菌發酵菊芋、木質纖維素、木薯原料的研究居多，但是L-乳酸光學純度不如以米根霉生產菌高［1-3］。我們通過引進高產優質的紅薯品種進行栽培，篩選出高淀粉產量的紅薯品種，并以之為原料進行了L-乳酸發酵的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

米根霉Fp-6(Rhizopus oryzae Fp-6)，由江西省科院生物技術有限責任公司分離保存。

1.1.2 紅薯品種

①梅營1 號;②秦薯5 號;③FL-19;④蘇薯303;⑤豫薯王;⑥徐薯22;⑦紅星431;⑧秦薯4 號。

1.1.3 培養基

(1)斜面培養基(%):馬鈴薯斜面(PDA)培養基，馬鈴薯200，蔗糖20，瓊脂20，水1 000 mL，pH自然。

(2)種子培養基(%):玉米淀粉5.0，葡萄糖5.0，(NH4)2SO40.135 ，無機鹽微量，CaCO31.0，115 ～120 ℃滅菌30 min。

(3)基礎發酵培養基(%):淀粉12，(NH4)2SO41.35，無機鹽 微量，消泡劑0.01 ～0.03，CaCO3在發酵過程中補加。

1.2 方法

1.2.1 培養方法

(1)斜面菌種培養:用少量無菌水(約5 ～10 mL)洗脫斜面孢子制成懸液，或直接挑取菌絲，接種于PDA 斜面上，于28℃培養10 ～14 d。

(2)一級種子液培養:將斜面孢子洗脫液接入錐形瓶中，使培養基中孢子終濃度為1.0 ×106～2.0 ×106CFU/mL。于30℃，200 r/min 搖床培養12 ～16 h。

(3)二、三級種子液培養:接種量5%，培養溫度，35 ℃，空氣流量0.1 ～0.25 vvm，轉速300 r/min，培養9 ～15 h。

(4)發酵:接種量5%，培養溫度35 ℃，通氣量:0.05 ～0.2 vvm，采用間斷添加25% ～30% 的無菌CaCO3溶液的方法控制pH 在5.5 ±0.5。

1.2.2 紅薯的預處理

(1)紅薯淀粉制備［4］:稱取紅薯100 kg，清洗，粉碎，用石磨研磨成漿，用2 ～3 倍體積的清水洗2 次，先后分別用20 目和100 目篩過濾，濾液靜置沉淀過夜，棄上清液，沉淀用清水清洗后靜置沉淀，棄上清液，沉淀置烘箱中烘干即為紅薯淀粉。

(2)去皮紅薯液化液的制備:紅薯蒸煮，去皮，磨碎，液化，濃縮備用。

(3)紅薯液化液的制備:紅薯蒸煮，磨碎，液化，濃縮備用。

(4)去有機N 紅薯液化液制備:紅薯洗凈稱重，加水粉碎，漿液靜置過夜，棄上清液，加水攪勻后靜置沉淀，棄上清液，液化，測定含糖量和總N 量，濃縮備用。

1.2.3 分析方法

(1)L-乳酸、富馬酸、甘油等含量分析:LC-10Avp型液相色譜儀(日本島津)，檢測器RID-10A 示差檢測器，色譜柱OAapak-A，柱溫40 ℃，流動相0.75 mmol/L H2SO4，分析流速1 mL/min，進樣量20 μL。

(2)L-乳酸光學純度分析:LC-10Avp 型液相色譜儀，檢測器SPD-10Avp 紫外檢測器，色譜柱SUMICHIRAL OA-5000(φ 4.6 mm×150 mm)，柱溫40 ℃，波長254 nm，流動相1 mmol/L CuSO4溶液，分析流速1 mL/min，進樣量10 μL。

(3)殘糖測定:發酵液于10 000 r/min 離心5 min，取上清液，采用DNS 顯色法測定糖濃度。

(4)淀粉含量測定［5］:參照GB/T5009.9 -2003。紅薯洗凈去皮后，切成細絲，稱取100 g 左右，并加入等量的水，用豆漿機打成勻漿，立刻稱取勻漿10 g，參照GB/T5009.9—2003 中酸水解法進行檢測。

(5)水分測定［6］:參照GB/T 5009.3—2003。

(6)N 含量測定［7］:凱氏定氮法，參照GB/T 5009.5—1985。

2 結果與討論

2.1 高淀粉紅薯品種的篩選和組分分析

共種植了8 個品種的紅薯，產量和組分見表1。

表1 不同品種紅薯畝產量和淀粉產量Table 1 Acre yield and starch acre yield of sweet potato varieties

紅星431 淀粉量最高，其次是豫薯王、梅營1 號、FL-19、秦薯5 號，其他低于20%，紅星431 淀粉含量和畝產淀粉量最高，但其含N 量也最高，雖然豫薯王淀粉含量比梅營1 號稍高，但其畝產量低，畝產淀粉亦低于梅營1 號，因此選用紅星431 和梅營1 號作為發酵試驗優質品種。

2.2 紅薯淀粉的制備

分別取紅星431 和梅營1 號鮮薯各100 kg，制備發酵用粗紅薯淀粉原料，分別測定淀粉提取收率。

表2 鮮薯制備淀粉過程中各參數Table 2 Parameters in the process of starch preparation with fresh sweet potato

影響淀粉收率的原因可能有以下2 種:(1)紅薯的粉碎程度，顆粒粉碎的大小可能影響紅薯中的淀粉完全釋放出來;(2)在濾渣的洗滌過程中，由于洗滌條件限制，淀粉可能不能完全洗至水中，部分淀粉被帶到廢渣中而影響最后的淀粉收率。改進粉碎紅薯和洗滌設備可提高淀粉收率。

2.3 搖瓶發酵產酸試驗

2.3.1 不同預處理紅薯對L-乳酸產量的影響

以3 種不同預處理的紅薯為原料，折成淀粉量為120 g/L，分別液化后，配制發酵培養基，采用一級種發酵，接種量10%，200 r/min，35 ℃培養48 h，發酵結束后發酵液定容至100 mL，分別測定光學純度、乳酸含量、殘糖量和菌體干重。

表3 不同預處理紅薯原料對L-乳酸產量的影響Table 3 The effect of sweet potato starch with different pre-preparation on L-Lactic acid yield

與對照玉米淀粉為原料的產酸水平相比，搖瓶發酵48 h，利用紅薯淀粉為原料發酵產酸水平、菌體干重和殘糖濃度均與玉米淀粉相同。而使用紅薯液化液發酵過程中，菌絲體量大大增加，為淀粉原料的4～6 倍，且菌絲體纏繞成大塊的團狀，產酸水平大大下降，這可能是由于紅薯中含有較豐富的有機N 源，米根霉在富有機N 培養基中過度繁殖生長，在搖瓶培養過程中菌絲體纏繞成大塊的團狀，影響O2的傳質，不利乳酸的生成。去皮紅薯液化液為原料的培養液中其菌體濃度最高，表明紅薯皮中可能含有可抑制菌體生長的因子。雖然利用紅薯淀粉發酵生產L-乳酸產量與玉米淀粉相似，產量最高，但從發酵成本考慮，制備紅薯淀粉生產流程長，且會造成一部分淀粉流失，同時有大量有機廢水排放，增加發酵原料成本和廢水處理運行成本，因此以下試驗均采用紅薯液化糖作為發酵原料。

2.3.2 紅薯中的有機氮濃度對米根霉菌絲體的生長和產L-乳酸產量的影響

在玉米淀粉為原料的發酵基礎培養基中添加不同濃度的有機N 源，有機N 來源為制備紅薯淀粉(紅星431)時的上清廢液，試驗Ⅰ組的有機N 的添加量分別為1.0，0.75，0.5，0.25 和0.125 g/L，不加無機N，試驗Ⅱ組除添加有機N 源外，再按常量添加無機N，分別考察有機氮濃度對菌體生長和產酸的影響，以及在不同有機N 濃度的條件下無機N 對米根霉發酵產酸的影響，結果見表4。

2 組試驗結果均表明，隨著紅薯中有機N 濃度的增加，菌體量明顯增加，為正常發酵菌量的2 ～6 倍。在未添加無機N 的條件下，發酵液中有機N 濃度低于0.5 g/L 時對產酸影響不大，但菌體量隨著有機N濃度的增加而明顯增加。當發酵液中有機N 濃度高于0.5 g/L 時，菌體生長過盛，嚴重影響產酸，產酸量明顯下降。在試驗Ⅱ組的結果與試驗Ⅰ組相似，但在相同的有機N 濃度條件下，添加無機N 能明顯促進乳酸的生成，尤其是在有機N 濃度低于0.5 g/L 時，加入無機N 源對產酸影響更加顯著。因此在以紅薯液化糖為原料發酵生產L-乳酸時，控制發酵液中有機N 濃度在0.5 g/L 內比較適宜。同時添加無機N 源有利于發酵產酸。

表4 有機N 和無機N 對米根霉發酵產酸的影響Table 4 The effects of organic N and inorganic N on L-Lactic acid fermenting by Rhizopus oryzea

2.3.3 C/N 比對L-乳酸發酵的影響

梅營1 號紅薯液化糖濃度為120 g/L 時，液化糖液中有機N 含量為0.51 g/L。玉米淀粉中有機N含量為0.13 g/L，(NH4)2SO4的添加分為2 組，一組按正常的添加量全部添加，另一組根據原料配比中的有機N 量，添加一定量的無機N 量，保持C/N=90。搖瓶發酵48 h，結果見表5。

表5 C/N 比對L-乳酸發酵的影響Table 5 The effect of C/N on L-Lactic acid fermenting

1 ～2 號為對照組，3 ～7 號為添加常量的無機鹽的試驗Ⅰ組，8 ～12 號為固定C/N 比為90 的試驗Ⅱ組。試驗Ⅰ組中隨著C 源配料中紅薯液化液添加量的增加，C/N 比從77 逐漸下降至54，菌體量和副產物甘油明顯增加，L-乳酸的產量逐漸減少，這進一步驗證紅薯液化糖中含有的有機氮會促使菌體生長過盛，導致菌絲結團，影響產酸速度和糖轉化率;當控制C/N 比為90 時，與對照組和試驗Ⅰ組相比，L-乳酸產量略偏低，且發酵液中副產物甘油和富馬酸含量明顯偏高，這表明無機N 對米根霉發酵生產L-乳酸具有促進作用。結果表明，適宜的C/N 比為在添加1.35 g/L 的(NH4)2SO4條件下，C/N 比≥65%有利于L-乳酸的發酵產酸。

2.3.4 50 L 罐發酵放大試驗

2.3.4.1 未去除有機N 的紅薯液化糖對發酵的影響

分別制備紅星431 和梅營1 號紅薯液化糖，當總糖濃度為120 g/L 時，紅星431 液化液和梅營1 號液化液中有機N 濃度分別為1.11 和0.51 g/L。根據搖瓶試驗結果，在50L 發酵罐中分別用玉米淀粉+紅星431 紅薯液化糖和梅營1 號紅薯液化糖為原料，試驗罐1 為玉米淀粉對照罐，罐2 為60 g/L 玉米淀粉+60 g/L 紅星431 紅薯液化糖，罐3 梅營1 號120 g/L紅薯液化糖，(NH4)2SO4添加量均為1.35 g/L，三罐為平行試驗，采用三級種發酵，比較發酵周期和糖轉化率。發酵結果見表6，發酵液中乳酸和殘糖變化見圖1。

表6 50 L 罐發酵結果Table 6 The results of fermentation in 50 L fermentor

圖1 發酵過程中L-乳酸和殘糖變化Fig.1 Transformations of L-lactic acid and residual sugar in the process of fermentation

由于紅薯漿液化糖中有機氮含量較高，在發酵前期，尤其是在發酵10 ～18 h，在攪拌和通氣條件下，發酵液大量起泡，必須流加消泡劑進行消泡，同時要降低攪拌速度和空氣流量，攪拌速度從200 r/min 降至120 r/min ，通氣量亦根據發泡的情況適時調節，溶氧比對照罐1 低20% ～40%，由于溶氧下降，副產物富馬酸和甘油濃度明顯高于1 號罐。發酵趨勢亦表明在發酵前期，以玉米淀粉為原料的罐1 產酸明顯較紅薯液化糖高，試驗罐2 和罐3 發酵周期延長了6 ～8 h，終糖轉化率亦比以玉米淀粉低。可能是由于前期為控制發酵液起泡，改變發酵控制條件而造成產酸延遲和發酵周期延長。菌體量比對照玉米淀粉為原料的罐1 高50%左右，這也是造成糖轉化率偏低的主要原因。

2.3.4.2 去除部分有機N 的紅薯液化糖對發酵的影響

由于紅薯液化糖中含有機N 高，在發酵罐發酵過程中會產生大量的泡沫，同時菌體量明顯增加，從而造成發酵過程控制難度，增大染菌機率，使產酸量下降，發酵周期延長，因此對紅薯糖化糖的制作進行了改進，即紅薯洗凈稱重后，加水粉碎，漿液靜置過夜，棄上清液，再加水，攪勻后靜置沉淀，棄上清，這樣可去除紅薯中絕大部分有機N，沉淀加淀粉酶液化，測定含糖量和總N 量。

試驗罐1 為玉米淀粉對照罐，罐2 為120 g/L 改進制作的紅星431 紅薯液化糖，其有機N 濃度為0.068 g/L，罐3 為120 g/L 改進制作的梅營1 號紅薯液化糖，其有機N 濃度為0.03 g/L，(NH4)2SO4添加量均為1.35 g/L，三罐為平行試驗，采用三級種發酵，比較發酵周期和糖轉化率。發酵結果見表7，發酵液中乳酸和殘糖變化見圖2。

經過去除有機N 的紅薯液化糖，在發酵過程中未發生大量起泡的現象，其發酵周期和糖轉化率均與以玉米淀粉為原料基本相同，乳酸產生和糖消耗速率無明顯差異，發酵副產物富馬酸和甘油濃度亦無明顯增加，發酵周期48 h，糖轉化率均≥80.0%，光學純度均為100%。可以取代玉米淀粉作為發酵原料。

表7 50 L 罐發酵結果Table 7 The results of fermentation in 50 L fermentor

圖2 發酵過程中L-乳酸和殘糖變化Fig.2 Transformations of L-lactic acid and residual sugar in the process of fermentation

3 結論

采用2 個高淀粉紅薯品種為原料，米根霉發酵生產L-乳酸，紅薯液化糖中的有機N 濃度對發酵影響顯著。在搖瓶發酵過程中表現為菌體量明顯增加，菌體量隨著有機N 濃度的增加而明顯增加，菌體量為淀粉原料的菌量的2 ～6 倍，且副產物富馬酸和甘油濃度亦呈增加趨勢。在50 L 罐發酵過程中，發酵前期會大量發泡，需流加消泡劑和控制攪拌速度和空氣流量進行消泡，這樣導致發酵前期產酸較低，發酵周期延長，富馬酸和甘油濃度亦有所增加，使乳酸產量和糖轉化率比淀粉糖略低。采用去除大部分有機N的紅薯液化糖進行50L 罐發酵，其糖轉化率≥80%，發酵周期為48 h，與淀粉類糖相同，完全可替代玉米淀粉作為原料生產L-乳酸。

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