一株瀝青質降解菌的篩選及其對稠油作用評價＊

宋永亭，宋 欣，高光軍，陳慶國，李 陽，包木太?

（1.中國海洋大學 化學化工學院，山東 青島 266100； 2.海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室（中國海洋大學），山東 青島 266100； 3.中國石化股份勝利油田分公司采油工藝研究院，山東 東營 257000； 4.中國石油化工股份有限公司，北京 100728）

目前在中國探明石油儲量中，開發難度較大的稠油接近40億噸，其資源量約占總石油資源的25%～30%，稠油開發日益顯示出重要的戰略地位.高黏度是稠油區別于常規原油的最基本特性，同時也是決定稠油開采難度和經濟成本的關鍵因素.稠油往往富含瀝青質，瀝青質是稠油組分中相對分子質量最大、極性最強的組分，也是造成稠油黏度大、開采難的一個主要因素[1－3].

利用微生物作用于稠油，改善稠油物性是石油開發領域的一項新興技術.目前的研究主要集中在微生物產生生物表面活性物質、酸、氣等代謝產物降低稠油黏度；在微生物對稠油中大分子組分的降解作用方面，國內外研究人員也做過一些探索研究.但是，關于能以瀝青質為唯一碳源生長，特異性降解瀝青質的菌種的相關研究報道較少[4－7].本文以瀝青質為唯一碳源，從稠油油田采出水中選擇性富集篩選瀝青質降解菌，獲得了一株能夠以稠油中瀝青質組分為唯一碳源生長的菌株S，利用該菌株對富含瀝青質的稠油進行了微生物降解評價實驗，分析了菌株對稠油物理化學性質的影響.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

正庚烷，甲苯，硝酸銨，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，七水硫酸鎂，氯化鈣，氯化鈉，葡萄糖，蛋白胨，酵母浸粉，瓊脂粉，稠油（黏度3 581mPa·s），Taqmix擴增體系.瀝青質抽提器，密度儀，黏度計，原油族組分測試儀，紅外光譜儀，核磁共振儀，天平，真空干燥箱，振蕩培養箱，PCR儀.

1.2 實驗方法

1.2.1 瀝青質降解菌的篩選

富集培養基：NH4NO3，1.0g／L；K2HPO4，1.5 g／L；KH2PO4，0.5g／L；MgSO4·7H2O，0.5g／L；CaCl2，0.02g／L；瀝青質，7g／L；調節pH 值至7.

固體 培 養 基：葡 萄 糖，3.0g／L；蛋 白 胨，3.0g／L；酵母浸粉，3.0g／L；NaCl，5.0g／L；K2HPO4，2.7g／L；瓊脂，20g／L；調節pH 值至7.

取10mL某稠油油田采出水于富集培養基內，37℃，160r／min振蕩培養14d后，將培養液在固體培養基上進行劃線分離，對作用前后的瀝青質進行紅外光譜和相對分子質量分析.

其中，稠油瀝青質的提取及其稠油族組分含量測定，采用中華人民共和國石油天然氣行業標準SY／T 5119—1995[6]進行；紅外光譜圖采用尼高力IR200紅外光譜儀測定；瀝青質相對分子質量采用蒸氣壓滲透法測定.

1.2.2 瀝青質降解菌的分子生物學鑒定

菌株16SrDNA測序：從固體平板上挑取少量菌體，用無菌水洗滌3次，離心取沉淀，稀釋液體作為模板，引物為細菌16SrDNA的PCR通用引物（27F，1492R），使 用 TIANGEN 公 司 生 產 的Taqmix體系進行PCR擴增.擴增產物送大連寶生物公司測序，將測序結果用BLAST與GenBank中的16SrDNA序列進行同源性比較.

1.2.3 瀝青質降解菌的稠油作用評價

評價培養基：NH4NO3，1.0g／L；K2HPO4，1.5 g／L；KH2PO4，0.5g／L；MgSO4·7H2O，0.5g／L；CaCl2，0.02g／L；稠油，10g／L；調節pH 值至7.

將活化的瀝青質降解菌的種子液按1%接種量接入評價培養基內，37℃，160r／min振蕩培養14 d，同時將不接菌的評價培養基在相同條件下培養，作為空白對照，對比兩者的稠油外觀、族組分、紅外光譜、支化指數、密度及黏度的差異.

其中，稠油核磁共振譜圖采用Bruker AVANCE 500Hz 500MHz超導核磁共振儀測定；稠油黏度采用中華人民共和國石油天然氣行業標準SY／T 7549—2000測定；稠油密度采用煤油稀釋法測定[8].

2 結果分析

2.1 瀝青質降解菌S的篩選與鑒定

通過分離純化，得到一株能以瀝青質為唯一碳源生長的菌株S.對菌株S進行革蘭氏染色表明，菌株S為革蘭氏陽性菌，短桿狀.利用細菌16SrDNA通用引物擴增菌株S的16SrDNA部分片段，將其序列提交GenBank數據庫進行系統發育對比，序列分析顯示菌株S與Bacillus屬的已確定的種的相似度為94%～99%，其中與BacillussubtilisBSn5的相似度最高，達到99%.系統發育樹用MEGA 3.1軟件建立，如圖1所示，顯示菌株S屬于Bacillus屬.

圖1 菌株S的16SrDNA序列系統發育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of 16SrDNA sequence of strain S

菌株S作用前后瀝青質的相對分子質量的測定結果見表1.菌株S作用后瀝青質相對分子質量降低，與作用前相比降幅達5.9%.

表1 菌株S對瀝青質相對分子質量的影響Tab.1 Molecular weight change of asphaltene before and after biodegradation by strain S

菌株S作用前和作用后的瀝青質紅外譜分析結果如圖2所示.

圖2 菌株S對瀝青質紅外譜圖的影響Fig.2 FTIR spectrum of asphaltene by strain S

從圖2可以看出，與作用前相比，菌株S作用后瀝青質在3 396cm－1處吸收峰銳減，該峰屬于分子間氫鍵多聚締合的譜峰，表明菌株S作用后重質組分之間相互締合的程度降低；在2 800～3 000cm－1處吸收峰增強，該峰是由于環烷烴和烷烴C－H振動產生的結果，表明瀝青質的分子結構更趨于飽和；1 600cm－1處吸收峰減弱，該峰是苯環吸收峰，表明瀝青質中芳香類結構減少；1 032cm－1處吸收峰略有增加，該峰是C－O鍵吸收峰，表明產生了氧化性產物.根據以上分析推測，菌株S通過對瀝青質的氧化作用，一方面降低重質組分之間相互締合的程度，另一方面減少芳香類結構，使瀝青質的飽和程度增加.

2.2 菌株S對稠油作用效果評價

2.2.1 稠油外觀變化

經過14d的培養后，空白對照實驗樣品中的稠油的外觀沒有變化，仍然呈現聚集狀態.與空白對照相比，接入菌株S的實驗樣品中的稠油在菌株S的作用下發生了明顯的乳化現象，并由最初的聚集狀態轉變為細小顆粒狀[9].稠油的表觀變化說明菌株S對稠油具有良好的乳化效果，如圖3所示.

圖3 空白對照與經菌株S作用后稠油的表觀變化圖Fig.3 The apparent change of heavy oil before and after biodegradation by strain S

2.2.2 稠油紅外光譜變化

培養14d后，分別取出空白對照及經菌株S作用后的稠油，進行紅外光譜分析，譜圖如圖4所示.

從譜圖可以發現，在2 800～3 000cm－1處稠油的紅外光譜出現很強的吸收峰，這些強的吸收峰是環烷烴和烷烴C－H振動的結果，其中以2 923 cm－1和2 852cm－1的－CH2－的吸收最強.1 455 cm－1和1 372cm－1附近均顯示出明顯的脂肪烴甲基和亞甲基的面內伸縮振動吸收峰.而1 455cm－1和1 598cm－1出現相對強峰可以表明該化合物中含有芳核結構.

對比空白對照樣與經菌株S作用后的稠油紅外光譜圖的變化可看出，經菌株S作用后稠油在3 450 cm－1處譜峰明顯減弱，該峰屬于分子間氫鍵多聚締合的譜峰，表明菌株S作用后重質組分之間相互締合的程度降低.從譜峰含量上來看2 800～3 000 cm－1，2 922cm－1和2 852cm－1處譜峰都有不同程度增加，可以認為減弱的重質組分相應轉化為飽和組分及芳香組分.

圖4 空白對照與經菌株S作用后稠油的紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectrum of heavy oil before and after biodegradation by strain S

2.2.3 稠油支化指數變化

核磁共振波譜廣泛用于有機化合物及其混合物的結構分析，1H－NMR（核磁共振氫譜）可以很清楚地區分與芳香碳相連的氫以及與飽和碳相連的氫.石油烴的支化指數（BI）是指其中碳鏈的分支程度[10].

式中：Hβ為芳香環β碳上的氫以及β位以遠的CH2和CH基上的氫原子數；Hγ為芳香環的γ位以及γ位以遠的CH3基上的氫原子數.

對菌株S作用后的稠油樣品和未添加菌株S的空白對照樣品利用核磁共振進行了檢測，對比譜圖發現2個樣品的譜圖具有明顯差異；而未添加S的樣品在培養前后無明顯差異，因此，僅給出空白和菌株S作用后的稠油核磁共振譜圖（如圖5所示）.根據譜圖得到不同稠油樣品相應的支化指數，見表2.

從表2中數據可看出，稠油經菌株S作用后樣品支化指數升高，這可能是由于稠油中瀝青質含量相對高，而瀝青質是以稠合芳香環系為核心，經菌株S作用后，其芳香環發生斷鏈開環作用，導致與芳香環相連的支鏈增多.

圖5 空白對照與經菌株S作用后的稠油核磁共振譜圖Fig.5 NMR spectrum of heavy oil before and after biodegradation by strain S

表2 菌株S對原油的支化指數的影響Tab.2 Influence of biodegradation on branching index of heavy oil by strain S

2.2.4 稠油族組分變化

測試了菌株S作用前后稠油樣品的族組分變化.添加菌株S培養14d后，稠油組分中的芳香烴含量增加最高，烷烴次之，而瀝青質含量則大幅度降低，其瀝青質降解率達到了34.87%.而未添加菌株S的空白對照在培養前后稠油組分沒有明顯變化，見表3.這是由于菌株S主要是作用于稠油中的瀝青質，使瀝青質結構發生變化，相應轉化為其他組分，從而改變了稠油族組分的結構組成.瀝青質是影響稠油黏度的主要因素之一，它的減少會使稠油黏度降低[11]，從而增加稠油流動性

2.2.5 稠油黏度與密度變化

通過對菌株S作用前后稠油黏度及密度的測定發現，添加菌株S培養14d后，稠油的黏度和密度都有不同程度的降低.而未添加菌株S的空白對照在培養前后稠油組分沒有明顯變化，見表4.

表3 菌株S對稠油族組分的影響Tab.3 Influence of biodegradation on composition of heavy oil by strain S %

表4 菌株S對稠油黏度、密度的影響Tab.4 Influence of biodegradation on viscosity and density of heavy oil by strain S

加入菌株S作用后，稠油的黏度、密度均降低.稠油黏度由作用前的3 576mPa·s降低至2 356 mPa·s，降黏率達到34.11%.稠油密度從作用前的0.997 3g·cm3降低至0.951 7g·cm－3，降幅達到4.57%.由此可看出，菌株S在一定程度上改變了稠油的物性.

3 結 論

1）通過一系列篩選實驗，得到一株能以稠油瀝青質為唯一碳源生長的菌株S，分子生物學分析結果表明，菌株S屬于Bacillus屬，與BacillussubtilisBsn5的序列相似度達99%.

2）菌株S以瀝青質唯一碳源，在有氧條件下利用氧化作用，一方面降低重質組分之間相互締合的程度，另一方面減少芳香類結構，使瀝青質的飽和程度增加.菌株S作用后，瀝青質相對分子質量降低5.9%.

3）菌株S能改變稠油組分，其作用稠油后可以導致組分中瀝青質含量降低及烷烴含量相應升高.

4）稠油經菌株S作用后，黏度和密度均出現不同幅度的降低，作用14d的降黏率達34.11%，密度降低了4.57%，物性得到明顯改善，表明菌株S在稠油的微生物開采和改質應用方面具有一定潛力.

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