腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體的可溶性表達及純化條件的優(yōu)化

趙 芳，劉 葉，呂 靜，代廣知，譚樹華

（中國藥科大學生命科學與技術(shù)學院，江蘇 南京210009）

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體（TNF－Related apoptosis－inducing ligand，TRAIL）或稱凋亡素2配體（Apoptosis ligand，APO－2L）是腫瘤壞死因子（TNF）超家族的新成員。人TRAIL分子由281個氨基酸組成，為Ⅱ型跨膜蛋白。TRAIL能夠選擇性地誘導多種腫瘤細胞凋亡，但對多數(shù)正常細胞沒有殺傷活性［1－4］，因此在腫瘤免疫治療中有很廣闊的應用前景。TRAIL胞外區(qū)部分形成的可溶性多肽（sTRAIL）已具有全長TRAIL的活性，也能與TRAIL的天然受體特異性地結(jié)合，使信號傳導途徑被激活，最終導致細胞凋亡［5，6］。

作者采用PCR方法，以人胎盤cDNA為模板，特異性地擴增出編碼TRAIL的可溶性片段（114～281個氨基酸）即sTRAIL的基因，然后成功構(gòu)建sTRAIL的原核表達載體，并在大腸桿菌中得到高效表達，優(yōu)化了sTRAIL的純化條件，獲得高純度的sTRAIL，并測定了其生物學活性。

1 實驗

1．1 質(zhì)粒、菌種和培養(yǎng)基

克隆載體pMD19－T，Takara公司；表達載體pTASH、大腸桿菌JM109均為自行保存。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母提取物0．5%，氯化鈉1%，氨芐青霉素100mg·L－1，pH值7．0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母提取物0．5%，谷氨酸鈉4%，麥芽汁1%，磷酸二氫鉀0．671%，磷酸氫二鈉0．757%，氨芐青霉素100mg·L－1，pH值6．5。

1．2 工具酶及試劑

Taq酶、限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ和 Hind Ⅲ、T4DNA連接酶，Takara公司；人胎盤cDNA，康為世紀公司；dNTP，南京生興公司；兔抗人TRAIL蛋白的抗體，巴傲得生物公司；HRP標記的羊抗兔IgG，BOSTER 公 司；SP－Sepharose FF、Q－Sepharose FF，GE公司。

實驗用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．3 方法

1．3．1 sTRAIL基因的克隆

1．3．1．1 引物設(shè)計與合成

參考已報道的sTRAIL的cDNA序列［6］，根據(jù)表達載體pTASH多克隆位點特點設(shè)計一對引物（由上海捷瑞公司合成），引物序列如下（下劃線部分為引入的Eco RⅠ、HindⅢ酶切位點）：

P1：5′－CCGAATTCATGGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAG－3′

P2：5′－GTAATCAAGCTTAGCCAACTAAAA－AGGCCCCGAAAAAACTG－3′

1．3．1．2 PCR擴增sTRAIL基因