大腸桿菌信號轉導系統研究進展

原榮榮，夏 遠

（內蒙古大學 生命科學學院，內蒙古 呼和浩特010021）

1 引言

大腸桿菌作為一種模式生物被廣泛用于細菌信號轉導機制的研究。盡管目前還有許多信號蛋白的生理功能還不清楚，但是由于其在信號轉導方面與其它一些原核生物或真核生物存在著許多相似性，目前仍被作為一種重要的研究模式菌。尤其是在大腸桿菌三種菌株全序列公布之后，為全面認識大腸桿菌基因組中各種與信號轉導機制相關的編碼信息創造了條件，從而在基因序列層面上，打開了對未知信號轉導蛋白生物功能與轉導機理研究的序幕。大腸桿菌作為一種研究廣泛的生物模式菌，其信號轉導機制要比一些相關的專性致病菌復雜，例如：嗜血性流感桿菌（Haemophilusinfluenzae）或嗜肺軍團菌（Legionellapneumophila）。另一方面，大腸桿菌編碼的信號轉導蛋白比其非共生條件致病菌少得多，例如銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）、沙雷菌（Shewanellaoneidensis）和霍亂弧菌（Vibrio cholerae）。因此大腸桿菌信號轉導是一個易于操作的試驗系統，能為了解真核生物信號轉導機理提供許多參考信息。

2 細菌信號轉導途徑的多樣性

大腸桿菌中所發現的組氨酸激酶（histidine kinases，HK）和甲基接受趨化蛋白（methyl－accepting chemotaxis proteins，MCPs）是兩類研究最多的與信號轉導相關的膜結合受體蛋白。隨著基因測序技術的快速發展以及生物分子學實驗技術的不斷進步，許多其它類型的信號轉導受體蛋白被相繼發現，其中包括絲氨酸/蘇氨酸（serine/threonine，Ser/Thr）蛋白激酶和蛋白磷酸酶、腺苷酸環化酶、二鳥苷酸環化酶和環化二聚單磷酸鳥苷（Cyclic dimeric guanosine monophosphate，c－di－GMP）特異性磷酸二酯酶［1］。

由組氨酸激酶和MCPs受體參與的信號傳遞過程常被定義為二組分信號轉導途徑，該過程涉及組氨酸激酶到響應調節蛋白之間的磷酸基傳遞的全過程。二組分信號轉導途徑形式極其多樣，一般包含三個基本過程：

（1）激酶分子上組氨酸殘基的磷酸化；

（2）磷酸基從組氨酸激酶轉移到與其同源的響應調節蛋白分子的天冬氨酸殘基上；

（3）響應調節蛋白的構象發生改變，使得其與染色體DNA分子上特定基因或者細菌鞭毛等其他結構的相互作用發生變化，在一些情況下表現為對酶活性的調節。

趨化信號傳遞是一種特殊的二組分信號轉導途徑，信號最先由MCPs開始傳遞，MCPs與組氨酸激酶CheA發生特異性反應，將磷酸基傳遞給響應調節蛋白CheY。CheY蛋白含有獨立受體結構域，但不含磷酸基輸出結構域。鞭毛的移動性主要基于磷酸化的CheY蛋白與位于鞭毛底端的FliM蛋白相互作用而實現，這種相互作用影響著鞭毛旋轉的方向，從而調節趨化響應［2］。

磷酸轉移酶系統（Phosphotransferase System，PTS）參與糖的吸收，該系統包含一系列負責在磷酸轉移過程中從磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate，PEP）向六碳糖（包括：N－乙酰甘露糖胺，葡萄糖，甘露糖，葡萄糖胺和N－乙酰葡萄糖胺等）轉移磷酸基的蛋白質。在大腸桿菌中的PTS磷酸轉移體系含有兩種關鍵蛋白——PTS酶Ⅰ與葡萄糖特異性酶II。PTS酶I（EI）的磷酸化水平直接影響著細胞的趨化性，而葡萄糖特異性酶II（EIIAGlc）的磷酸化水平調節著細胞中腺苷酸環化酶的活性［3］。

Ser/Thr蛋白激酶主要通過將細胞中靶蛋白上的絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化及去磷酸化等一系列級聯反應傳遞信號。Ser/Thr蛋白激酶不僅存在于真核生物中，同時也存在于原核生物體內，但目前為止大腸桿菌體內只有很少一部分蛋白被證實通過這一途徑實現信號轉導。在某些情況下，Ser/Thr蛋白激酶自身具有去磷酸化活性。研究發現，Ser/Thr蛋白磷酸酶對靶蛋白的去磷酸化反應與Ser/Thr蛋白激酶的磷酸化反應是一對互逆反應［4］。

環化單磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate，cAMP）是細胞體內一種關鍵的第二信使，通過與不同啟動子的相互作用，對轉錄加以調控。環化單磷酸腺苷的細胞水平受到腺苷酸環化酶的調節。這種調節機理包括cAMP受體蛋白（cAMP receptor protein，CRP）與cAMP的特異性結合，隨后觸發CRP構象發生變化，增加其與DNA的親和力，從而活化其它一些與其相應的基因或操縱子的轉錄。

c－di－GMP是另外一種存在于細胞內的第二信使，在生物體內通過二鳥苷酸環化酶信號轉導通路來調控其生理功能。c－di－GMP調節與細胞表面成分有關的多種功能，包括：菌體運動，蛋白質和多聚糖的分泌，生物膜的組成和某些致病因子的生成。c－di－GMP的某些生理功能是通過與PilZ結構域的結合來實現調節，其他功能可能包含有另外的結合蛋白，包括二鳥苷酸環化酶本身。c－di－GMP特異性磷酸二脂酶用于催化c－di－GMP水解，同時也能作為c－di－GMP的結合蛋白［5］。

3 大腸桿菌的信號轉導機制

3.1 二組分組氨酸激酶

細菌基因組編碼的組氨酸激酶種類繁多，這些感受蛋白主要分布于細胞膜，用于響應轉導不同類型的刺激信號。大部分組氨酸激酶的差異源于感受蛋白與識別信號分子結構域的不同，它存在于外周胞質，嵌入膜內或者細胞質。典型的組氨酸激酶是一個跨膜受體，常常包含多個感受結構域，例如，位于外周胞質感受結構域以及細胞質中的配體結合PAS（Per－ARNT－Sim，PAS）結構域。兩者相比而言，組氨酸激酶在細胞質中的信號轉導模體相當地統一，都含有兩個結構域，即由長α螺旋和C末端球狀ATP酶結構域組成的二聚化/磷酸化組氨酸激酶A（Histidine Kinase A，HisKA）結構域。組氨酸激酶在信號傳遞過程常以二聚體形式存在。二聚體中一個分子的ATP酶結構域結合ATP并將其γ磷酸基轉移到其他二聚體分子HisKA結構域保守區的組氨酸殘基上，接著又將磷酸基轉移到與其同源的響應調節蛋白的接收結構域天冬氨酸殘基上。

大腸桿菌K12編碼30種組氨酸激酶，其中有6種功能還不清楚（RstB，YehU，YpdA，YfhK，and YedV），余下的 24 種分別為：BaeS，BasS，CpxA，EvgS，RcsC，and RscD用于響應外膜壓力［6］；EnvG 與KdpD用于響應滲透壓以及鉀離子濃度梯度的調節；PhoQ，PhoR用于感應磷酸鹽和鈣鎂離子；NarQ，NarX用于感應硝酸鹽與亞硝酸鹽；ArcB，BarA感應氧和過氧化氫；CusS，ZraS用于重金屬的感應（例如：Cu＋、Ag＋、Zn2＋和 Pb2＋）；二羧酸鹽和三羧酸鹽由 CitA 和DcuS感應；六磷酸葡萄糖（UhpB），谷氨酰胺（GlnL），N－氧三甲胺（TorS），乙酰醋酸鹽（AtoS），QseC負責群體感應［7］。

人們越來越關注有多少種組氨酸激酶同時感應外膜壓力和滲透壓，或是細胞氧化還原電位和末端電子受體濃度。事實上，不同組氨酸激酶共存于同一細胞，它們之間按照一定的精度相互作用。例如，NarQ和NarX之間存在著復雜的功能劃分。但是，在很多情況下，二者之間功能層次體系還不為人所知［8］。Noriega等研究發現，NarX－NarL和NarQ－NarP對硝酸鹽的響應調節是一個不對稱交聯調節系統，NarQ與響應調節蛋白NarL和NarP具有相似的結合力，而NarX更偏向于與NarL蛋白相互作用［9］。

3.2 二組分響應調節蛋白

二組分響應調節蛋白是一類含有共同磷酸基受體REC結構域（receiver domain）的不同蛋白質的總稱，REC結構域常常也稱作CheY同源受體結構域。這個結構域催化磷酸基從組氨酸激酶HisKA結構域的組氨酸殘基轉移到響應調節蛋白的天冬氨酸殘基，同時也參與其自身的去磷酸化反應。每種響應調節蛋白的REC結構域都具有以上兩種活性，這決定著其磷酸化形式的半衰期長短，在任意給定時間，響應調節因子活化分子的活性構象（磷酸化）所占的比例。絕大多數響應調節蛋白不僅含有REC結構域，而且還具有多種信號輸出結構域。但是一些響應調節蛋白，例如趨化響應調節蛋白CheY，只含有一個獨立的REC結構域。CheY僅通過蛋白與蛋白之間的相互作用實現信號的傳遞。磷酸基從CheA轉移到CheY分子上，構象發生改變，使得其與位于鞭毛底端的目標分子Flim的親和力增強。雖然未被磷酸化的CheY也能與FliM相互作用，但親和力較弱。所以CheY的磷酸化只是讓這兩種基本形態之間的平衡發生了偏移，這種平衡的改變直接導致鞭毛旋轉狀態的改變，從而表現為整個細胞流動性能的變化［10］。

除了CheY蛋白家族成員外，所有其他響應調節蛋白都是雙結構域（或三結構域）蛋白，含有REC結構域和信號輸出結構域，常位于多肽鏈C末端。這些蛋白中的大多數通過對特定目的基因轉錄的活化或者抑制來實施調控。絕大多數輸出結構域通常與DNA相結合，但一些響應調節蛋白的輸出結構域也能與酶或者配體相互作用。通常與DNA結合的響應調節蛋白屬于OmpR/PhoB家族，具有翼狀螺旋－轉角－螺旋DNA結合域。在大腸桿菌中，OmpR/PhoB家族包含有全部32種響應調節蛋白中的14種。NarL/FixJ家族含有9種響應調節蛋白，這些蛋白具有典型的螺旋－轉角－螺旋DNA結合輸出結構域。另外一些較為少見的DNA結合響應調節蛋白主要有Fis類型（NtrC家族）和LytTR類型（LytR/AgrA家族）分別含有4種和2種響應調節蛋白。雖然DNA結合響應調節蛋白的結構不同，但在響應外界信號刺激時，都遵循著一種普遍性機制。一般情況下，REC結構域的磷酸化反應有利于其從過渡態轉化為具有活性的二聚體形式。響應調節蛋白二聚體的形成是二組分系統進行轉錄調節的關鍵步驟。響應調節蛋白二聚體與染色體上串聯（或回文）結構的轉錄調節蛋白結合位點具有較高的親和力。每種響應調節蛋白對特異性信號的傳遞過程取決于REC結構域與同源組氨酸激酶以及HTH結構域與DNA目標靶點之間緊密的相互作用。因此，轉錄調節因子即使具有相似的基因序列（例如：OmpR和PhoB），生物功能也可能明顯不同。有些響應調節蛋白含有多個結構域。在NtrC家族轉錄調節因子中，其N末端具有REC結構域，C末端具有結合DNA特異位點的類似Fis結構域，這兩個結構域被AAA型ATP結合域分開，當與DNA分子結合后，表現出ATP酶活性。總之，細菌響應調節蛋白含有種類繁多的輸出結構域，處于信號傳遞鏈上游，能夠合理控制細胞新陳代謝，對環境因素的變化做出適應性響應［11］。

3.3 甲基受體趨化蛋白系統

大腸桿菌K12編碼5種甲基接受趨化蛋白（MCPs）。下列分別為5種MCPs以及各自感應的信號分子：Tsr（絲氨酸）、Tar（天冬氨酸，麥芽糖）、Trg（核糖，半乳糖）、Tap（二肽）和Aer（呼吸鏈的氧化還原態）。其中Aer是細胞用于感應末端電子受體的關鍵蛋白之一，其決定著呼吸代謝和發酵代謝在細胞體內的主導性。所有這類MCPs都與趨化組氨酸激酶CheA存在著相互作用，并且通過磷酸級聯過程將各自信號傳遞給趨化響應受體蛋白CheY［12］。

3.4 磷酸轉移酶系統

磷酸烯醇式丙酮酸依賴的糖磷酸轉移酶系統（Phosphoenolpyruvate－dependent sugar：phosphotransferase system，PTS）是一種獨立于MCP趨化調節機制的信號轉導途徑，不僅用于一些特定糖的催化吸收，而且參與磷酸化底物的交聯膜運輸。在PTS運輸糖底物的過程中，同時給趨化系統和腺苷酸環化酶發出偶聯信號。PTS蛋白的磷酸化反應與組氨酸激酶類似，都是組氨酸殘基被磷酸化。但與ATP－His－Asp或ATP－His－Asp－His－Asp級聯過程等典型二組分信號轉導過程相比，PTS磷酸級聯過程始于磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvic acid，PEP），在隨后的參與傳遞的各組分中（EI，HPr和EIIA）都只含有一個 His殘基。PEP水解釋放足夠的高自由能，確保在缺少糖類底物的情況下，所有PTS各組分處于磷酸化形式。整個磷酸級聯過程的限速步驟為EI依賴PEP的自磷酸化反應。當有糖類存在的條件下，PTS組分的磷酸基被快速傳遞給糖底物，其速率遠大于PEP對EI的二次磷酸化過程，導致EI，HPr和EIIA組分部分去磷酸化，此時也會同時向大腸桿菌趨化系統和腺苷酸環化酶發出信號。盡管PTS組分與MCP或CheA之間是否存在直接相互作用還未得到證實，但現有數據顯示，未被磷酸化的EI能夠與CheA相互作用，從而調節CheA活性與CheY～P的細胞水平。

第二種PTS信號轉導機制中包括有EIIAGlc。這種蛋白質能夠與腺苷酸環化酶和乳糖通透酶等目標分子相互作用。大腸桿菌細胞編碼23種PTS膜組分蛋白，其中有5種（FruA，FrvB，FrwC，HrsA and YpdG）對果糖具有特異性，根據現有試驗數據和序列預測，其他PTS膜組分蛋白對以下糖類存在特異性：葡萄糖（PtsG），甘露糖（ManX/Y），甘露糖醇（MtlA，CmtA），N－乙酰氨基葡萄糖（NagE），纖維二糖（AscF，CelB），半乳糖醇（GatC，SgcC），N－乙酰氨基半乳糖（AgaC/D，AgaW），山梨糖醇（SrlA），麥芽糖（MalX），海藻 糖（TreB），α－糖苷（GlvC），β－糖苷（BglF），抗壞血酸鹽（SgaB）和 N－乙酰胞壁酸（YfeV）［13］。

因此可以看出，大腸桿菌基因組基因編碼的趨化受體幾乎包含所有常見的單糖和多種二糖。這些基因的表達水平是否歸因于細胞的自身行為，目前仍然是一個懸而未決的問題。目前看來，至少有一些PTS受體基因需要被相應的糖誘導才能得以表達。

3.5 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和蛋白質磷酸酶系統

蛋白質上的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上的可逆磷酸化反應是真核生物細胞中一種關鍵的調節機制。一直以來，Ser/Thr蛋白質激酶被稱為“真核細胞”蛋白激酶。但事實上，許多原核生物中也存在有Ser/Thr蛋白質激酶。在一些細菌（放線菌）和古生菌中，Ser/Thr蛋白激酶在信號轉導過程中擔負著非常重要的作用，且存在著不止一種與之對應的受體蛋白。

包括大腸桿菌在內的很多腸細菌都編碼1種或2種Ser/Thr蛋白質激酶和磷酸酶，目前對其特性的了解還較少。起初人們發現UbiB功能類似于2－辛異戊烯基酚羥化酶，在輔酶Q生物合成過程的羥基化反應中扮演關鍵角色。通過序列分析和實驗證實，UbiB被認為是Ser/Thr蛋白質激酶超家族的一員，所有關鍵活性位點上的殘基都具有保守性。但輔酶Q生物合成過程是由UbiB調節，還是由Ser/Thr蛋白質激酶來調控，目前都還不得而知。YegI是另外一種被預測的Ser/Thr蛋白質激酶，有關其功能的研究目前還處于空白［14］。

3.6 腺苷酸環化酶系統

細菌自身編碼有多種腺苷酸環化酶，這些酶以ATP為底物合成cAMP。大腸桿菌腺苷酸環化酶是一種可溶性酶，本身并不表現出感應任何外界環境信號的能力。但是，其活性通過葡萄糖特異性磷酸轉移酶系統的EIIAGlc組分進行調節。EIIAGlc的磷酸化形式能夠活化腺苷酸環化酶，當細胞外葡萄糖濃度較高時，EIIAGlc表現為去磷酸化形式，不與腺苷酸環化酶結合，結合甚至被抑制。因此，當有葡萄糖或其他PTS糖存在的情況下，腺苷酸環化酶的活性會減弱，導致細胞中cAMP的含量降低。這也是產生分解代謝物阻遏現象的機制之一［15］。

3.7 二鳥苷酸環化酶與c－di－GMP磷酸二脂酶系統

許多細菌受體蛋白大多都具有GGDEF和EAL結構域，分別用于合成和水解第二信使c－di－GMP，控制c－di－GMP在細胞體內的平衡。目前研究顯示，c－di－GMP與調節生物膜的形成、鞭毛發育和其他多種生理過程有關。

GGDEF結構域約180個氨基酸殘基，功能類似于二鳥苷酸環化酶（diguanylate cyclases，DGCs），以兩分子GTP為底物生成一分子c－di－GMP。EAL結構域約260個氨基酸殘基，功能類似于c－di－GMP特異性磷酸二酯酶（phosphodiesterases，PDEs），將一分子cdi－GMP水解為線性的pGpG，最終分解為兩分子GMP。大腸桿菌編碼12種蛋白質具有GGDEF結構域，10種具有EAL結構域，7種同時含有以上兩種結構域。由此可以推測同時含有以上兩種結構域的蛋白質可能具有催化以上兩種反應的活性，在大多數情況下，兩種結構域中當一種具有調節催化活性時，另一結構域則失活。但在少數情況下，兩種結構域也會同時具有活性［16］。

目前對于大腸桿菌二鳥苷酸環化酶和c－di－GMP特異性磷酸二酯酶相關功能的了解還十分有限。O2（CO、NO）是眾多感受配體中的一種，與之對應的YddN蛋白被稱為“O2直接感受器”，簡稱Dos。其他含有GGDEF或EAL結構域的蛋白有：Rtn，YcdT，YddV，YdeH，YeaI，YeaJ，YeaP，YedQ，YegE，YfeA，YfgF，YfiN，YhjK，YliF，YneF，YahA，YcgF，YcgG，YdiV，YhjH，YjcC，YlaB，YliE，YoaD，目前對于這些蛋白感受信號刺激以及相應的調節機理還不為人所認知［17，18］。由基因芯片分析結果發現［19］，YegE，YahA和YaiC蛋白分別受到二組分系統中的UvrT，ArcA和UvrY蛋白正向調控，而YlaB同時受到ArcA和YedW/YedV正向調控。可以推測二組分信號系統可能與c－di－GMP第二信使在信號傳遞過程中存在著相互聯系。

4 大腸桿菌信號轉導多種信號復合應答

通過以上介紹可以看出大腸桿菌的信號轉導機制是一個復雜的相互聯系的網絡結構，是細胞應對環境變化，做出應答的基礎。環境參數的改變誘導不同的響應通路，表現出不同的響應水平，包括：基因水平（單個基因和操縱子的表達），細胞水平（趨化性，不同信號系統之間的交流），多細胞通訊水平（群體感應，生物膜的形成）。基因表達的調節是多方面的，不僅在轉錄階段（改變某一基因、操縱子，甚至全局調節因子的表達），還表現在后轉錄（mRNA衰減速率調節）和翻譯后調節階段（酶活性的調節，蛋白質穩定性，或蛋白質之間的相互作用）。

在大腸桿菌體內存在的信號轉導機制中，大部分的細胞響應既表現于轉錄調節水平又表現為整個細胞的響應行為，例如：趨化性。大腸桿菌的二組分信號轉導系統主要是在轉錄水平上進行調節，在32種二組分響應調節因子中，有29種能與DNA分子結合。趨化性信號轉導途徑只包含CheY、CheB兩個響應調節蛋白和單一的響應調節蛋白（RssB or Hnr）參與反應后水平的調節。其中RpoS水解反應的等級最終影響到RpoS依賴基因的轉錄。

另一條環境信號調節轉錄水平的途徑是cAMPCRP系統。正如前面所提到的，通過PTS吸收糖類物質能夠影響腺苷酸環化酶的活性，因此，不同分解代謝抑制敏感啟動子的轉錄。通過序列分析，Ser/Thr蛋白質激酶YegI的C末端含有螺旋－發夾－螺旋DNA結合域，故也參與轉錄調節。細胞二鳥苷酸環化酶引導的信號通路也能夠對轉錄加以調節，這就使得轉錄調節可能具有多種調控途徑，但目前還沒有試驗對這種推論加以證實［20］。

整個細胞行為水平的改變包括：①細胞趨化響應不同糖、多種氨基酸以及細胞氧化還原電位的變化；②胞外多糖和庫利菌毛的合成，最終導致生物膜的形成。這兩種細胞行為變化可能反映出細胞在“保持”與“趨化”兩種生存模式直接的選擇，這一過程似乎被c－di－GMP信號轉導途徑所支配。另外，c－di－GMP信號途徑可能與二組分調控系統（TCS）共同發揮作用。大多數GGDEF和EAL結構域并非獨自存在，其中部分被歸入了TCS［21］。c－di－GMP可能是許多胞外信號在胞內共同的第二信使。許多GGDEF和EAL結構域蛋白鑲嵌在細胞膜上或與細胞膜相連，具有信號感應結構域，能夠感應胞外信號，并傳至胞內［22］。c－di－GMP可能與細菌群體感應（QS）聯系密切。QS與cdi－GMP調控著許多相同的細胞功能（生物膜形成、多細胞性和毒性），所以這兩個信號傳導機制很可能是相互聯系的。

相同的細胞響應可以根據環境觸發參數加以分類。目前對組氨酸激酶、MCPs和PTS的膜組分感應環境信號的研究，已成為信號轉導領域的熱點。一方面，大腸桿菌細胞實時監測著外界環境壓力和胞外營養物質濃度的變化。對前者而言，主要包括：外膜壓力，滲透壓，重金屬離子，膜穿透酸（乙酸鹽或者苯甲酸鹽）。后者主要包括：己糖，多種二糖，二羧酸鹽或三羧酸鹽，除核糖以外的戊糖和除谷氨酸、絲氨酸、天冬氨酸以外的氨基酸。所有這些化合物對于大腸桿菌的新陳代謝都是非常重要的，例如為什么大腸桿菌主要對己糖敏感，而不是戊糖，或對特定氨基酸敏感，而不是谷氨酸或者天冬氨酸。這些特征可能反映出，大腸桿菌和一些其他腸細菌在富含營養的腸環境適應過程操控機制的簡化。

5 展望

盡管目前對于細菌信號轉導的研究取得了重要的進展，但即使是被研究得很透徹的大腸桿菌K12模式菌，仍然還存在著許多亟待解決的有關信號轉導途徑的科學疑問。通過對大腸桿菌信號轉導網絡系統的研究以及與誘導信號對應的細胞內部或者細胞間的響應調控是將來深入研究的主要方向。對信號轉導機制的深入了解并將不同調控機制完美地整合于大腸桿菌代謝途徑，構建一套完整的信號轉導模型可能是不久的將來該領域研究所面臨的主要挑戰。

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