內毒素耐受及相關機制探討

楊 虎綜述，李運璧 審校

(1.瀘州醫學院，四川 瀘州 646000;2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院兒科，四川 成都 610072)

內毒素(endotoxin，ET)又名脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，是革蘭陰性(G－)細菌細胞壁上的主要成分。LPS通過激活單核－巨噬細胞系統(mononuclear phagocytic system，MPS)引起白細胞介素－1(IL－1)、腫瘤壞死因子－α(TNF－α)等大量炎性介質的釋放，引起全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、膿毒癥(sepsis)、嚴重膿毒癥(severe sepsis)、膿毒性休克(septic shock)的發生，導致機體嚴重損傷甚至死亡。然而，機體感染G-細菌后的臨床表現輕重不一，表明機體對LPS的反應存在差異性，該差異性除了因LPS的感染量和質的不同所引起外，還與機體本身對LPS的耐受性不同有關，即產生了內毒素耐受(endotoxin tolerance)。內毒素耐受是指機體經過小劑量LPS刺激后，對致死劑量LPS的再次刺激呈低反應或無反應的一種狀態。經內毒素耐受后的機體，當再次受到內毒素刺激時其細胞因子的釋放量、細胞及組織的損傷程度都明顯低于非耐受機體。目前認為，內毒素耐受是機體在長期進化過程中形成的一種保護性自身調節機制，是一種適應性應答，避免了機體對LPS刺激的過度反應，是機體防御機制的重要組成部分［1］。內毒素耐受的機制比較復雜，至今尚未完全闡明，目前的研究認為其與介導細胞因子產生的介質表達下調及負性調節細胞因子產生的介質表達上調有關。其中前者以Toll樣受體(Toll－like receptor，TLR)通路的改變研究的較多，而后者則少有研究或報道。

1 TLR通路

TLR由基因dToll所編碼，而該基因最早發現于人們研究果蠅的胚胎發育中。1996年，Lemaitre等發現dToll發生突變的果蠅極易感染真菌，提示Toll受體具有介導抗真菌感染信號轉導的功能［2］。1997年，Medzhitov等在哺乳動物中發現了第一個果蠅Toll樣受體的同源物，后被命名為TLR4，其能誘導炎癥應答基因的表達，并為LPS誘導信號轉導的重要受體。繼后，在哺乳動物中Toll受體的同源受體相繼被發現，構成Toll樣受體家族(TLRs)。迄今為止，在哺乳動物中已發現TLR家族成員共15種，人類特異性表達TLR1－10，而TLR11、12和13只在鼠中表達［3］。近來TLR14和TLR15也相繼在小鼠和雞體內發現［4，5］。TLRs廣泛分布于固有免疫系統細胞及部分非免疫細胞表面，如單核巨噬系統、中性粒細胞、T/B淋巴細胞、NK細胞、上皮細胞等。TLRs是一種模式識別受體(Pattern recognition receptor，PRRs)，能夠識別微生物進化過程中的一些保守結構即病原體相關分子模式(Pathogen－associted molecular patterns，PAMAs)，介導機體的固有性免疫應答，從而誘導適應性免疫應答的發生［6］。TLRs屬于Ⅰ型跨膜受體，分為胞外段、跨膜段及胞內段3區域。胞外段為富含亮氨酸的重復序列(leucine rich repeat，LRR)，可與 CD14 分子結合，參與PAMAs的識別，從而啟動信號轉導。胞內段與白介素－1受體(IL－1R)的膜內區高度同源，含有一個信號轉導結構域，稱為TIR結構域(Toll/IL－1R homology domain)。另外，胞內段尚可募集一特殊的蛋白分子—髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)，其為TLR通路上關鍵的銜接蛋白。LPS激活TLR4主要有兩條信號轉導通路，而MyD88即為該兩條亞通路的分界點。通常根據有無MyD88的參與，可將TLR通路分為:MyD88依賴型信號通路;MyD88非依賴型信號通路［7］。

2 TLR4信號轉導通路與內毒素耐受

在TLRs眾多家族成員中，TLR4最被人們所熟知，其是唯一可經MyD88依賴型和MyD88非依賴型兩條信號通路轉導信號的TLRs成員［8］，也是LPS所介導的TLR受體通路的主要成員。而大量研究表明，LPS耐受與TLR4信號轉導通路間有著密切的關聯。

2.1 LPS 結合蛋白(LPS binding protein，LBP)、CD14與內毒素耐受 當LPS進入體內后首先與血清中LBP結合形成復合物，LBP再與具有高親和力的LPS受體CD14分子相互作用，使細胞表面的TLR4形成同二聚體并結合MD－2。此后LPS與LBP分離并與TLR4/MD－2復合物結合(MD－2負責與 LPS結合，而 TLR4與 LPS不直接相互作用［8］)。至此，TLR4被徹底激活，信號轉導的大門由此打開，并經MyD88依賴型及非依賴型信號通路向下傳遞。研究發現在無LBP參與下，小鼠腹腔巨噬細胞也能產生內毒素耐受，提示內毒素耐受與LBP無明顯相關性。亦有實驗證明內毒素耐受時CD14分子并未發生實質性改變，且在CD14抗體存在的同時內毒素耐受同樣能夠誘導成功，故 CD14分子與LPS耐受間無直接關系。

2.2 TLR4/MyD88依賴型信號通路與內毒素耐受活化后的TLR4與細胞內含有TIR結構域的接頭蛋白TIRAP(TIR domain－containing adaptor protein，TIRPAP)相互作用，募集同樣含有TIR結構域的接頭蛋白MyD88，MyD88通過其死亡結構域(death domain，DD)再與含有DD的IL－1受體相關激酶(IL －1 receptor associated kinase，IRAK)家族成員結合，二者相互作用導致IRAK的自身磷酸化而活化，活化的IRAK招募并激活腫瘤壞死因子受體相關因子(TNF－α receptor associated factor，TRAF)家族成員中的TRAF－6［9］。TRAF－6下游的信號通路分為2條，分別激活NF－КB誘導激酶(NF－КB inducing kinase，NIK)和有絲分裂原結合蛋白激酶(Mitogen －activated protein kinase，MAPK)家族，最終導致轉錄因子NF－КB和AP－1(activator protein－1)的活化。活化的轉錄因子轉至胞核，啟動相應靶基因的表達，最終導致多種細胞因子的產生［10］。

2.2.1 TLR4與內毒素耐受 Nomura等用不同劑量LPS二次重復刺激小鼠腹腔巨噬細胞以建立LPS耐受模型后發現，細胞因子的分泌與LPS的劑量及處理后的時間呈時間依賴性減少，同時TLR4的表面表達在數小時內呈梯度下降，并持續達24小時之久，證明了細胞因子的分泌下降與TLR4表達下降呈正相關。這與陳華文等［11］對預先經小劑量LPS刺激的大鼠再次予以較大劑量LPS刺激后其白細胞粘附因子及TLR4均較對照組明顯下降的結論吻合。二者均充分說明了TLR4表達的下降為內毒素耐受的重要機制之一。

2.2.2 MyD88與內毒素耐受 大部分MyD88是以一種非活性形式存在于細胞骨架中，即與β肌動蛋白結合形成一種復合物［12］。當 TLR通路被激活后，肌動蛋白重排，MyD88釋放至細胞質中，并被招募至TLR/IL－1R處，以此鏈接下游信號。雖然目前尚缺乏確切證據來顯示LPS耐受時MyD88的具體變化，但早在1999年便發現MyD88基因敲除小鼠的巨噬細胞及胚胎成纖維細胞缺乏對LPS的反應性，并對LPS產生了耐受性，說明了MyD88的信號轉導作用對LPS反應是基本的及LPS耐受與MyD88之間的重要關系。

2.2.3 IRAK與LPS耐受 目前已發現的IRAK家族成員有4個，分別是:IRAK－1、IRAK－2、IRAK－M和IRAK－4，其中IRAK－1和IRAK－4有激酶活性，而IRAK－2和IRAK－M無激酶活性。IRAK－1、IRAK－2、IRAK－4均在激活轉錄因子NF－КB中發揮重要作用，而IRAK－M卻因其在TLR信號轉導通路中的負性調控作用而備受關注［13］。有研究發現在對THP－1細胞進行初次內毒素刺激時，IRAK能夠被快速激活，表達增加并與MyD88迅速結合;而在內毒素耐受的THP－1細胞中IRAK表達數量顯著下降、IRAK的酶學活性消失且與MyD88的結合發生障礙，使內毒素誘導的信號轉導受阻于此。IRAK在參與內毒素耐受機制的建立中有重要作用。

2.2.4 MAPK與內毒素耐受 MAPK家族是一組可被多種信號激活的絲/蘇氨酸蛋白激酶，位于胞漿信號轉導通路的末端，活化后轉位至核內，并作用于相應轉錄因子，調節基因表達。目前被發現的MAPK亞族共有 4個:P38、ERK、ERK5以及JNK4［6］。而LPS可激活MAPK家族成員發生級聯反應，促使下游分子磷酸化，進而誘導多種炎癥因子和抗炎因子的基因表達。研究發現內毒素耐受小鼠巨噬細胞經LPS再次刺激時，P38、ERK等磷酸化程度均明顯減弱，從而降低對LPS的過度反應。由此可知，MAPK家族與LPS耐受有著密切關系。

2.2.5 NF－КB與內毒素耐受 NF－КB是由兩個亞基組成的同二聚體或雜二聚體，屬于轉錄激活因子。在無刺激因素作用時，NF－КB雜二聚體位于胞漿中并與其抑制蛋白IКB相結合。在外界刺激因素作用下，IКB激酶(IKK)被激活，催化IКB的磷酸化，使泛素化并被蛋白酶體降解。活化的NFКB轉移至細胞核內，與NF－КB反應元件相結合，調節基因表達。內毒素耐受細胞中IKK不能被激活，使IКB無法降解并持續與NF－КB結合，從而抑制NF－КB轉位至胞核影響基因表達。

2.3 TLR4/MyD88非依賴型信號通路與內毒素耐受 TLR4除可經MyD88依賴途徑傳導信號外，亦可經MyD88非依賴途徑傳導。而MyD88非依賴通路轉導需要含TIR的接頭蛋白(TIR domain－containing adaptor－inducing IFN －B，TRIF)的參與，因此也稱TRIF依賴性途徑。活化后的TRIF可使IFN調節因子3(IFN regulatory factor 3，IRF3)發生磷酸化，最終誘導產生主要的轉錄因子［14］。LPS可以刺激MyD88缺陷的巨噬細胞表達干擾素誘導蛋白，該干擾素誘導蛋白基因的表達需要依賴TLR4，但不依賴MyD88，而是通過干擾素調節因子3和NF－КB發生的。研究表明，在此途徑中TLR4先活化TRIF相關接頭分子(TRIF－related adaptor molecule，TRAM)，再通過TRAM與TRIF結合。至目前為止，尚未見LPS耐受與MyD88非依賴型信號通路之間關系的具體報告，因此其也將成為LPS耐受機制的另一探索領域。

3 與內毒素耐受相關的負性調節分子

研究表明，LPS耐受除可通過TLRs通路表達下調建立耐受機制外，亦與一些負性調節分子有關。這些負性調節分子因位置分布不同，被分為膜上的蛋白和胞漿中的因子［15］。膜上蛋白包括細胞表面的清道夫受體SR－A(Scavenger receptor A)、RP－105(TLR4同源體)、以及內體膜上受體NOD2(Nucleotide－binding oligomerization domain 2)等。以上物質的負性調節作用機制均未完全闡明，研究表明，其大多數物質均與抑制TLR4通路某環節的表達或(和)分子之間的鏈接有關。如，SR－A可能是通過結合和吞噬LPS，減少TLR4與其配體結合而減少基因表達。而RP105則與MD－1形成復合物，然后通過MD－1直接與MD－2作用，特異性地抑制TLR4信號轉導通路［16］。胞漿中的因子有MyD88s、IRAK－M、細胞因子信號傳導抑制因子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)等。MyD88s為 MyD88的同源物，缺少MyD88的中間結構域(TIR區和DD區之間的110～157個氨基酸)，此結構域的缺失使IRAK磷酸化發生障礙，進而使信號下傳受阻。IRAK－M作為IRAK家族中的負性調節因子，通過抑制IRAK－4誘發的IRAK－1的磷酸化，阻止下游IRAK/TRAF－6復合體形成，導致TLRs信號中斷［17］。研究發現，在小鼠內毒素耐受模型中，低劑量LPS刺激IRAK－M表達上調，而較高劑量LPS誘導時IRAKM表達則上升，提示LPS耐受與IRAK－M關系密切［18］。細胞因子信號傳導抑制因子(SOCS)是新近發現的具有負性調控細胞因子產生的蛋白分子。SOCS家族已發現有8個成員，分別命名為SOCS－7和CIS，其大多均可通過負性調控JAK/STAT通路起免疫調控作用。而在眾多家族成員中，SOCS－1與內毒素耐受形成的機制關系最為密切。陳先鋒等［19］通過對小鼠建立內毒素耐受模型發現，實驗動物在表現出對內毒素耐受的同時，其肝組織中SOCS－1基因的表達明顯增強，提示SOCS－1基因的表達與內毒素耐受的形成有密切關系。

4 內毒素耐受與兒童內毒素血癥及膿毒癥

膿毒癥是由感染所誘發的全身性炎癥反應，是兒科重癥監護病房(PICU)中危重患兒死亡的常見原因之一［20］。引起膿毒癥的感染因素包括細菌、病毒、真菌、支原體等，其中以革蘭陰性細菌感染造成的膿毒癥最為常見。當機體感染革蘭陰性細菌后，其釋放的脂多糖進入血液，即造成內毒素血癥;另外，在強有力的抗生素應用下，細菌大量死亡破壞，亦可使LPS釋放造成內毒素血癥。當膿毒癥發生時大量細胞因子釋放形成細胞因子風暴，造成機體嚴重損傷，其中內毒素成為刺激細胞因子產生的主要元兇，故膿毒癥與內毒素血癥二者之間密不可分。內毒素血癥為臨床常見的急危重癥之一，其具有起病急，進展迅速，病死率高等特點。兒童由于其免疫系統尚未發育成熟，不能有效地將病原體或毒素局限、清除，故成為內毒素血癥的高發人群。據Watson等［21］報道，在美國兒童嚴重膿毒癥死亡率為10.3%，并成為PICU中主要死亡原因之一，其中革蘭陰性菌感染所致膿毒癥占據相當大部分比例，故內毒素血癥亦成為兒童死亡的重要病因之一。目前對內毒素血癥的治療缺乏有效的措施已成為臨床工作的一大瓶頸。而內毒素耐受的發現，在降低內毒素血癥、膿毒性休克、多器官功能衰竭等所造成的死亡率上起重要作用，為臨床治療內毒素血癥提供了新的思考方向。如為內毒素血癥高危人群預先進行減毒LPS或LPS類似物(如單磷酸類脂A，其人體可接受的安全劑量是LPS的10000倍，比LPS具有更大的安全性)刺激，建立內毒素耐受機制，以減少內毒素血癥發生時的炎癥反應程度及組織損傷;另外，對已發生內毒素血癥的患者，可應用對TLR4通路具有阻斷作用的相關藥物，以減少細胞因子的瀑布樣釋放，提高內毒素血癥的治療效果。如Tidswell等［22］發現大劑量 E5564(一種 TLR4阻斷劑)的治療可明顯降低膿毒癥患者的病死率;再者，內毒素耐受相關負性調節分子的發現，亦有可能成為內毒素血癥治療藥物的新選擇。

［1］ 劉虹，劉鴻翔，龔建平，等.內毒素耐受發生機制的研究進展［J］.重慶醫學，2006，35(9):850 －852.

［2］ 常曉彤，輦曉峰，王振輝.Toll樣受體信號轉導途徑研究進展［J］.生理科學進展，2011，42(5):340 －346

［3］ Huang B，Zhao J，Unkeless JC，et al.TLR signaling by tumor and immune cells:a double edged sword［J］.Oncogene，2008，27(2):218－224.

［4］ Higgs R，Cormican P，Cahalane S，et al.Induction of a novel chicken Toll－like receptor following Salmonella enterica serovar typhimurium infection［J］.Infect Immun，2006，74(3):1692－1698.

［5］ 于高水，楊玉榮，梁宏德.Toll樣受體研究進展［J］.細胞生物學雜志，2009，31(3):339 －343.

［6］ 李維朝，蔣電明，朱鳳臣，等.內毒素耐受的分子機制研究進展［J］.中國免疫學雜志，2010，26(8):764 －768.

［7］ Mogensen TH.Pathogen recognition and inflammatory signaling in innate immune defenses［J］.Clin Microbiol Rev，2009，22(2):240－273.

［8］ 何維，曹雪濤，熊思東，等.醫學免疫學［M］.第2版.北京:人民衛生出版社，2010:8.

［9］ Wang Y，Zhang P，Liu Y.TRAF－mediated regulation of immune and inflammatory responses［J］.Sci China Life Sci，2010，53:159 －168.

［10］ Lu YC，Yeh WC，Ohashi PS.LPS/TLR4 signal transduction pathway［J］.Cytokine，2008，42(2):145 －151.

［11］ 陳華文，祝偉，李樹生.內毒素預處理對內毒素血癥大鼠肝TLR4、NF－kB和ICAM－1表達的影響［J］.華中科技大學學報，2011，12(6):96 －99.

［12］ 梁小明，陳昌輝.髓樣分化因子88在Toll樣受體信號通路中的作用及臨床意義［J］.實用兒科臨床雜志，2012，27(15):1197－1200.

［13］ 鄭佳佳，萬敬員.IRAK－M在TLRs信號轉導中負性調節作用的研究進展［J］.生命科學，2009，21(3):430 －433.

［14］ Ropert C，Franklin BS，Gazzinelli RT，et al.Role of TLRs/MyD88 in host resistance and pathogenesis during protozoan infection:lessons grom malaria［J］.Semin Immunopathol，2008，30(1):41 －51.

［15］ 葛睿，田景琦，張學軍，等.TLRs的負性調節因子［J］.天津醫科大學學報，2009，15(2):331 －334.

［16］ Divanovic S，Trompette A，Atabani SF，et al.Negative regulation of Toll－like receptor 4 signaling by the Toll－like receptor homolegRP105［J］.Nat Immunol，2005，6(6):571 －578.

［17］ del Freson C，Soler－ Rangel L，Soare－Schanoski A，et al.Inflammatory responses associated with acute coronary syndrome up－regulate IRAK－M and induce endotoxin tolerance in circulating monocytes［J］.J Endotoxin Res，2007，13:39 －52.

［18］ van‘tVeer C，van den Pangaart PS，van Zoelen MAD，et al.Induction of IRAK－M is associated with lipopolysaccharide tolerance in a human endotoxemia model［J］.J Immunol，2007，179(10):7110 －20.

［19］ 陳先鋒，李旭宏.SOCS－1在內毒素血癥及耐受小鼠肝組織中的表達變化及意義［J］.世界華人消化雜志，2010，18(17):1747－1755.

［20］ 李運璧，李建超.膿毒癥患兒低蛋白血癥與降鈣素原的相關性研究［J］.實用醫院臨床雜志，2012，9(5):115 －117.

［21］ Watson RS，Carcillo JA.Scope and epidemiology of pediatric sepsis［J］.Pediatr Crit Care Med，2005，6(3 Suppl):S3－S5.

［22］ Tidswell M，Tillis W，Larosa SP，et al.Phase 2 trial of eritoran tetrasodium(E5564)，a Toll－ like recep－tor 4 antagonist，inpatients with severe sepsis［J］.Critical Care Medicine，2010，38(1):72 －83.