葡聚糖蔗糖酶的研究進展

黃華波，譚周進

（1.湖南農業大學生物安全科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南中醫藥大學醫學院，湖南 長沙 410208）

葡聚糖蔗糖酶（Glucansucrase）是一類α-轉糖苷酶，能以蔗糖為受體底物，在無其它物質參與反應時生成α-葡聚糖，當有可識別的外源受體存在時，也能將葡糖基轉移給外源受體而生產各種糖基化產物。因葡聚糖蔗糖酶反應的特異性、產物的多樣性以及對于產物合成的可操作性而使其成為生物催化合成中一種重要的工具酶。在飼料、食品、醫藥等工業領域有著廣泛的應用前景。

1 葡聚糖蔗糖酶的種類與特性

通常蔗糖轉糖苷酶（Sucrose-utilizing transglucosidases）可以分為糖苷水解酶70 和13 兩個家族[1]，除淀粉蔗糖酶（Amylosucrases）屬于GH13 家族外，大多數葡聚糖蔗糖酶都屬于GH70 家族，淀粉蔗糖酶主要是一類酶促轉化合成淀粉的催化劑。它并非降解淀粉，而是將蔗糖合成與淀粉類似的多聚糖。葡聚糖蔗糖酶的主要反應是產生胞外多聚糖，這些α-葡聚糖以不同類型的糖苷鍵相連，他們的結構和分子量大小是由酶的特異性和產酶菌株決定的。根據產生不同多聚糖的類型，葡聚糖蔗糖酶可以分為5 類，這些不同的多聚糖特征一是分子量達到106 以上，另一個是D-葡糖基單位以不同的共價鍵連接，如α-1，6、α-1，3、α-1，4、α-1，2 糖苷鍵等。主要以α-1，6 鍵連接的多聚糖稱為Dextrans（右旋糖苷），生產此類的酶稱為Dextransucrases（右旋糖酐蔗糖酶DSR），主要發現在明串珠球菌屬；Mutansucrases 主要分離自鏈球菌屬，合成α-1，3 鍵型葡聚糖，稱為Mutan，通過加強鏈球菌在牙齒表面的定植和吸附而在齲齒的形成中扮演重要角色；Reuteransucrases，主要發現在乳酸菌屬，產生葡聚糖主要是α-1，4 和α-1，6 鍵；Alternansucrases，主要由明串珠球菌屬產生，合成非典型的α-1，3 與α-1，6 交替的葡聚糖，稱為Alternan；Amylosucrases（淀粉蔗糖酶），來自于GH13 家族，主要發現于奈瑟氏菌屬、異常球菌屬和交替單胞菌屬，產生一個由α-1，4 鍵構成的與淀粉高度相似的多聚糖[2-4]。

葡聚糖蔗糖酶可由不同的菌種產生，這些菌屬包括：明串珠菌屬、乳酸菌屬、魏斯氏菌屬、鏈球菌屬、異常球菌屬、奈瑟氏菌屬、交替單胞菌屬、假單胞菌屬和雙歧桿菌屬。

2 酶的催化反應機制與結構分析

在酶促低聚糖的合成途徑中，葡聚糖蔗糖酶不需要添加糖核苷酸或1-磷酸葡萄糖，僅以蔗糖的分解供能就能合成需要的糖苷，在經濟上具有無可比擬的優勢。一般來說，主要的催化反應包含2 個步驟。第一步（葡萄糖基步驟），親核殘基表現出對糖基環變旋異構效應的碳原子進行親核攻擊，并且同時，催化酸（谷氨酸）使蔗糖供體配糖體的氧原子質子化。這就導致了一個β-D-葡糖基酶共價中間體的形成和果糖的釋放；第二步（去葡萄糖基步驟），通過去質子化的羧酸基團攻擊糖苷環異頭C1原子與天冬氨酸之間的共價鍵而將葡糖基分子轉移給活性受體[5]。除了生成低聚糖外，通過葡糖基復合體構造的逆反應還能產生蔗糖同分異構體。

來源不同的葡聚糖蔗糖酶結構上都具有高度的相似性，比如GH13 家族和GH70 家族的酶體系構架采取（β/α）8管狀結構[6]，是由8 個平行的β 折疊形成的內部β 管被8 個α 螺旋圍繞所形成，因此單個的α 螺旋和β 折疊相互交替并以環形連結。然而兩者活性中心的拓撲結構也顯示了明顯的差異。在20 世紀90年代，人們就已經克隆出葡聚糖蔗糖酶GTF-I 全基因片段，并在體外成功表達出高純度的GTF-I，從而也對該酶的蛋白質結構做出了預測。直到2008年，Dijkstra 等才成功的捕捉到GTF180 葡聚糖蔗糖酶的晶體結構，從而也證實更早對于（β/α）8管狀結構的預測。2011年，日本靜岡縣立大學、東京大學等聯合機構首先通過人工方法大量制造出來自于口腔鏈球菌的葡聚糖蔗糖酶GTF-SI，隨后使其結晶，并通過X 射線進行分析，首次弄清楚了導致齲病的葡聚糖蔗糖酶的立體結構，研究發現，盡管該酶與α-淀粉酶結構類似，但它存在淀粉酶中并沒有的螺旋結構部分，推測就是這些部分參與了葡聚糖的制造[7]。

3 葡聚糖蔗糖酶的外源受體反應

除了體系中只存在蔗糖的反應外，當一個羥基化受體，如一個糖、一個酒精、一個多元醇或者一個黃酮類物質加入到反應混合物中，葡聚糖蔗糖酶的催化活性能夠從天然反應重新定向為為這些外源受體轉糖基，如果這些受體能夠被酶很好的識別的話[8]。研究顯示，一些受體物質被糖基化后，其穩定性、溶解性或生物利用度等顯著增加[9-12]。

從20 世紀50年代開始，人們就知道葡聚糖蔗糖酶能夠催化外源受體發生轉糖基反應。短的葡糖基低聚糖通過二糖的延伸而形成，這些二糖有麥芽糖、異麥芽糖、黑曲霉糖和龍膽二糖。葡糖基化反應產率與酶對受體分子的識別和反應條件有關。工業上，DSR-S 利用外源底物合成一系列與低聚麥芽糖類似的低聚半乳糖，和工業生產從淀粉降解得到的低聚麥芽糖酶促轉糖基產生的低聚麥芽糖苷有結構的類似性，這些產物是日本市場上出現的主要益生元成分。DSR-E 是來自于腸明串珠菌NRRL B-1299 的一種葡萄聚糖蔗糖酶，合成一種包含29% α-1，2 糖苷鍵的葡萄聚糖，當用麥芽糖作受體時，這種特異性得到維持，結果產生一系列在非還原末端包含或不包含α-1，2 糖苷鍵的低聚糖，這種低聚半乳糖不能被人和動物的消化酶所消化，以動物模型進行的研究顯示，他們能夠被來自于人腸道微生物區系的細菌所代謝，因此被應用于皮膚美容中用于維持皮膚微生物區系的平衡[13]。

除了麥芽糖和異麥芽糖，來自明串珠菌屬葡聚糖產生菌NRRL B21297 的交替蔗糖酶被發現能以龍膽二糖作為底物合成糖基化龍膽二糖，是一種潛在的益生元，而且沒有龍膽二糖的苦味[14]。更有趣的是，葡聚糖蔗糖酶還可以利用許多外源的底物來合成不同的糖苷，這些底物包含糖類（半乳糖、木糖、鼠李糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺），芳香族物質（兒茶素、木犀草素、槲皮苷、楊梅酮），醇類（鄰羥基苯甲醇、不同鏈長的主要醇類）和氨基酸衍生物等[15-17]。

2000年Hartmans 等[18]系統研究了變形鏈球菌GS-5 株GTF-D 非糖基受體特異性和反應條件的優化。結果表明，二羥基芳香烴化合物如鄰苯二酚、4-甲基鄰苯二酚和3-甲氧基鄰苯二酚都能夠被GTF-D 高效的轉糖基，當糖受體濃度為40 mmol/L，且以200 mmol/L 蔗糖作為糖供體反應時，以上化合物糖基化產率分別為65%、50%和75%。3-甲氧基間苯二酚也能夠被轉糖基，但效率極低，許多其它的芳香族化合物如苯酚、間羥基苯甲醛、間苯二酚等不能夠被GTF-D 轉糖基。因此可以推斷GTF-D 芳香族受體需要2 個相鄰的羥基基團。同時還研究了各種親水性的有機化合物作為助溶劑以促進難溶于水的糖受體的轉糖基作用。選擇黃酮類兒茶素作為一個模式受體，二乙二醇二甲醚（MEE）作為可用的助溶劑。當反應體系中添加15% MEE 時，黃酮類兒茶素轉糖基效率提高4 倍，其水中溶解度提高12 倍，10%～30%的MEE 同時也能夠用于兒茶酚、4-甲基鄰苯二酚、3-甲氧基鄰苯二酚的轉糖基反應中，但過高的受體濃度有時候能夠使酶失活而抑制反應。

4 酶工程改造與方法

當天然的葡聚糖蔗糖酶用于大規模的工業合成來生產各種低聚糖或糖基化產物時，往往會因為酶的底物特異性、穩定性或催化效率等因素而受到限制。為了克服這些限制因素擴充酶的工業應用，近年來發展的蛋白質工程方法能對酶的催化特性進行改造而提供了一種全新的手段。人們期望酶可以高效的合成設定的產物，并且盡量減少副反應。酶工程策略也叫定向進化，是基于通過隨機突變或重組建立突變體文庫，并用合適的方法進行選擇，最終得到功能改進的酶。這些方法的優勢是不需要弄清楚酶的三維結構，就能夠顯著的檢測到酶對特定底物的活性和其它的特性如溶解度和熱穩定性等的提高。

Vander Veen 等[19]采用易錯PCR 進行基因重組并通過選擇性篩選能夠從多糖奈瑟菌中產生更高效的、差異性的淀粉蔗糖酶。從突變體文庫使用只含有蔗糖作為唯一碳源的固體培養基來篩選得到具有淀粉蔗糖酶活性的克隆。結果表明，其中最好的分離酶種N387D 催化效率提高了3 倍，另一個改進的酶E227G 相對于野生型酶能夠合成更長的淀粉鏈。這個小組還從一個含有60 000 個克隆的突變體文庫中，篩選出3 株淀粉蔗糖酶的重組酶（2 株雙突變和1 個單突變），顯示他們在50℃的熱穩定性相對于野生型提高了3.5～10 倍。半衰期活性最好的突變株在50℃能夠保持32 min，而野生型在這個溫度3 min 內幾乎全部降解。在50℃，用改進的突變體和高濃度蔗糖合成淀粉，相比在30℃的原酶能夠得到原來2 倍的淀粉鏈長度[20]。來自于GH70 家族的葡聚糖蔗糖酶的轉糖基活性也被定向進化而得到提高了。用超軟X 射線照射腸膜明串珠菌B-742CB 葡聚糖蔗糖酶基因，產生的葡聚糖蔗糖酶催化活性提高2.3 倍，并且目前酶合成更多重分枝的α-1，3 糖苷鍵的多聚糖[21]。

來源于腸膜明串珠菌NRRL B-1299 的葡聚糖蔗糖酶DSR-E，天然以α-1，6 和α-1，2 糖苷鍵合成，通過改造后得到的一個突變株能僅以α-1，2糖苷鍵合成[22]。使用一個半理性的改造方法，對來自于鏈球菌的GTF-R 靠近過度穩定區域的2 個氨基酸位點進行修飾，最終該酶的催化特異性從α-1，6 鍵轉為α-1，3 鍵，同時它的轉糖基效率和活性都得到保留。野生型GTF-R 主要合成α-1，6 糖苷鍵（超過62%）產物，而突變體則主要以α-1，3 糖苷鍵（超過46%）合成葡聚糖多聚物[23]。有時候通過改變葡聚糖蔗糖酶其中的一個氨基酸，它就能從合成多聚糖改為合成低聚糖。從腸膜明串珠菌NRRL B-512F 產生的DSR-S 和DSR-T5 首先對受體結構域進行突變，然后將2 個酶重組得到單個酶突變體GS，可以產生與父母代合成的結構有差異的葡聚糖。試驗表明，重組酶能夠產生包含α-1，6、α-1，3 和α-1，4 鍵的水溶性葡聚糖[24]。

5 總結與展望

上述研究表明，通過葡聚糖蔗糖酶的天然反應，可以用可再生原料來生產各種不同類型的葡聚糖、葡糖基低聚糖和葡糖基衍生物。目前已經能夠把葡聚糖蔗糖酶結構與功能關系的研究與蛋白質工程技術的發展相結合，從而使它的功能和應用得到極大的提高。新的葡聚糖蔗糖酶能夠發生自然界不存在的與之等價的酶所催化的反應以及表現出新的特征，從而人們利用這個催化工具來生產更多的生物活性糖苷（例如抗生素、激素、甜味素、生物堿、黃酮類等）。這種巨大的潛能甚至能夠讓人們設想葡聚糖蔗糖酶β-糖苷鍵產物的出現。

采用何種方法來擴充葡聚糖蔗糖酶在生物合成中的應用？又將遵循什么樣的指導方法來完成這個目標呢？首先，要想更深入在分子水平了解葡聚糖蔗糖酶的特性，將需要得到酶的大量的三維立體結構信息，必須在能夠為工程酶的理性設計提供更多必要信息方面做最大的努力。然而，酶工程策略的成功也很大程度上依賴于有效的檢測方法的設計，從而從大量的文庫中分離出需要的突變體。這就意味著需要設計更多自動化的和敏感的檢測實驗方法。另一個具有挑戰性的方面是對于酶工程的快速、預測性設計缺少必要的酶系統動力學信息。對于酶結構和動力學方面突變效應的預測仍是一個難題。分子動力學、蛋白質模擬以及底物動力學相結合的生物物理技術構象變化的應用依然受困。多學科綜合無疑將促進這個領域的重大發展，計算機技術在提高酶的重組效率方面扮演重要角色，新技術的應用將提高酶的表達、效率、穩定性和專一性，也就是說，改造出理想的葡聚糖蔗糖酶為更好的生物催化所利用。

[1]Gilbert H J，Davies G，Henrissat B，et al.Recent advances in carbohydrate bioengineering[M].Cambridge，1999，3-12.

[2]Emond S，Mondeil S，Jaziri K，et al.Cloning，purification and characterization of a thermostable amylosucrase from Deinococcus geothermalis[J].FEMS Microbiol Letters，2008，285：25-32.

[3]Ha S J，Seo D H，Jung J H，et al.Enzymatic synthesis of salicin glycosides through transglycosylation catalyzed by amylosucrases from Deinococcus geothermalis and Neisseria polysaccharea[J].Carbohydrate Research，2009，344：1612-1619.

[4]Potocki-Veronese G，Putaux J L，Dupeyre D，et al.Amylose synthesized in vitro by amylosucrase：morphology，structure，and properties[J].Biomacromolecules，2005，6：1000-1011.

[5]Jensen M H，Mirza O，Albenne C，et al.Crystal structure of the covalent intermediate of amylosucrase from Neisseria polysaccharea[J].Biochemistry，2004，43：3104-3110.

[6]Pijning T，Vujicic-Zagar A，Kralj S，et al.Biochemical and crystallographic characterization of a glucansucrase from Lactobacillus reuteri 180[J].Biocatalysis and Biotransformation，2008，26：12-17.

[7]Ito K，Ito S，Shimamura T，et al.Crystal structure of glucansucrase from the dental caries pathogen streptococcus mutans[J].Journal of Molecular Biology Weyand，2011，408：177-186.

[8]Bertrand A，Morel S，Lefoulon F，et al.Leuconostoc mesenteroides glucansucrase synthesis of flavonoid glucosides by acceptor reactions in aqueous-organic solvents[J].Carbohydr Research，2006，341：855-863.

[9]Chung M J，Sung N J，Park C S，etal.Antioxidative and hypocholesterolemic activities of water-soluble puerarin glycosides in HepG2 cells and in C57 BL/6J mice[J].European Journal of Pharmacology，2008，578：159-170.

[10]Andre I，Potocki-Veronese A，Morel S，et al.Sucrose-utilizing transglucosidases for biocatalysis[J].Carbohydrates in Sustainable Development，2010，294：25-48.

[11]Lee C K，Le Q T，Kim Y H，et al.Enzymatic synthesis and properties of highly branched rice starch amylose and amylopectin cluster[J].Agricultural and food chemistry，2008，56：126-131.

[12]Seo D H，Jung J H，Ha S J，etal.Highly selective biotransformation of arbutin to arbutin-α-glucoside using amylosucrase from Deinococcus geothermalis DSM 11300[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2009，60：113-118.

[13]Sanz M L，Gibson G R，Rastall R A.Influence of disaccharide structure on prebiotic selectivity in vitro[J].Agricultural and Food Chemistry，2005，53：5192-5199.

[14]Cote G L.Acceptor products of alternansucrase with gentiobiose.Production of novel oligosaccharides for food and feed and elimination of bitterness[J].Carbohydr Research，2009，344：187-190.

[15]Champion E，Andre I，Mulard LA，et al.Synthesis of L-Rhamnose and N-Acetyl-D- glucosamine derivatives entering in the composition of bacterial polysaccharides by use of glucansucrases[J].Carbohydrate Chemistry，2009，28：142-160.

[16]Yoon S H，Fulton D B，Robyt J F.Enzymatic synthesis of two salicin analogues by reaction of salicyl alcohol with Bacillus macerans cyclomaltodextrin glucanyltransferase and Leuconostoc mesenteroides B-742CB dextransucrase[J].Carbohydr Research，2004，339：1517-1529.

[17]Seibel J，Hellmuth H，Hofer B，et al.Identification of new acceptor specificities of glycosyl transferase with the aid of substrate microarrays[J].Chembiochem，2006，7：310-320.

[18]Gerwin H.Meulenbeld，Hartmans S.Transglycosylation by Streptococcus mutans GS-5 glucosyltransferase-D：acceptor specificity and engineering of reaction conditions[J].Biotechnol Bioengineering，2000，70（4）：363-369.

[19]Vander Veen B A，Potocki-Veronese G，Albenne C，et al.Combinatorial engineering to enhance amylosucrase performance：construction，selection，and screening of variant libraries for increased activity[J].FEBS Letters，2004，560：91-97.

[20]Emond S，Andre? I，Jaziri K，Potocki-Veronese G，et al.Combinatorial engineering to enhance thermostability of amylosucrase[J].Protein Science，2008，17：967-976.

[21]Kang H K，Seo E S，Robyt J F，et al.Directed evolution of a dextransucrase for increased constitutive activity and the synthesis of a highly branched dextran[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2003，26：167-176.

[22]Fabre E，Bozonnet S，Arcache A，et al.Role of the two catalytic domains of DSR-E dextransucrase and their involvement in the formation of highly α-1，2 branched dextran[J].Bacteriology，2005，187：296-303.

[23]Hellmuth H，Wittrock S，Kralj S，et al.Engineering the glucansucrase GTFR enzyme reaction and glycosidic bond specificity：toward tailor-made polymer and oligosaccharide products[J].Biochemistry，2008，47：6678-6684.

[24]Funane K，Ishii T，Terasawa K，et al.Construction of chimeric glucansucrases for analyzing substrate-binding regions that affect the structure of glucan products[J].Bioscience，Biotechnolgy，and Biochemistry，2004，68：1912-1920.