雙鹵代均三嗪活性染料及其水解產(chǎn)物的HPLC分離方法的建立

胡玲玲， 范雪榮

(1. 江南大學 紡織服裝學院, 江蘇 無錫 214122; 2. 紹興文理學院 紡織服裝學院, 浙江 紹興 312000)

雙鹵代均三嗪活性染料及其水解產(chǎn)物的HPLC分離方法的建立

胡玲玲1,2， 范雪榮1

(1. 江南大學 紡織服裝學院, 江蘇 無錫 214122; 2. 紹興文理學院 紡織服裝學院, 浙江 紹興 312000)

為研究雙鹵代均三嗪活性染料的水解反應(yīng)，采用反相離子對高效液相色譜對雙鹵代均三嗪活性染料及其水解產(chǎn)物進行了色譜分離。從雙鹵代均三嗪活性染料的選擇、色譜柱的選擇、流動相的選擇和優(yōu)化、柱溫的確定等方面，探討了對稱結(jié)構(gòu)雙鹵代均三嗪活性染料及其水解產(chǎn)物的HPLC分離方法的建立過程，利用該方法對雙一氟均三嗪活性染料活性紅LS-2G及雙一氯均三嗪活性染料活性紅KE-3B的水解產(chǎn)物進行了分離，得到了較好的分離效果。

活性染料； 雙鹵代均三嗪活性染料； 水解； 動力學； 高效液相色譜法

活性染料的水解活性通常通過測定染料的水解速率進行研究。由于活性染料水解主要發(fā)生在活性基團上，而活性基團并不是發(fā)色團的典型部分，且不是影響UV-VIS染料吸收光譜的主要部分，因此，測定染浴中水解染料量不能借助于光譜學的方法。研究工作者相繼采用了薄層層析法[1]、滴定總堿度法[2]、氟/氯離子選擇電極滴定法[3]和比色測定法[4]等測定活性染料的水解反應(yīng)速率，但這些方法局限性較大，有的靈敏度不高，有的操作極不方便，難以推廣，給研究工作帶來一定的困難。

使用高效液相色譜法(HPLC)對活性染料及其水解產(chǎn)物進行定性及定量分析，具有簡單、快速、準確等優(yōu)點，目前已成為測試活性染料水解量的主要方法。HPLC研究的首要問題是確定色譜分離的條件。由于HPLC在印染行業(yè)應(yīng)用較晚，對染料及其反應(yīng)產(chǎn)物的色譜分離缺乏積累，因此可供參考的分離方法很少，又由于實驗條件和樣品的不確定性，導致多數(shù)情況下需要開發(fā)新的色譜分離方法。但由于HPLC在方法開發(fā)時涉及影響因素較多，需要大量探索性實驗，如果沒有系統(tǒng)的理論和經(jīng)驗給予指導，將會耗費大量的時間、金錢和精力。鑒于目前HPLC在印染行業(yè)的應(yīng)用現(xiàn)狀，系統(tǒng)地了解和掌握色譜方法開發(fā)過程中的影響因素，快速建立有效的研究方法，提高實驗的準確性和精度可能比實驗本身更為重要。本文以雙一氟均三嗪活性染料活性紅LS-2G和雙一氯均三嗪活性染料活性紅KE-3B及其水解產(chǎn)物的色譜分離為例，分析了雙鹵代均三嗪活性染料及其水解產(chǎn)物的色譜分離方法的建立過程，為其應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 實驗藥品與儀器

藥品：活性紅KE-3B(C.I.活性紅120)，活性紅LS-2G(C.I.活性紅268)，四丁基溴化銨C16H36BrN，磷酸二氫銨NH4H2PO4，氫氧化鈉NaOH，碳酸氫鈉NaHCO3，磷酸氫二鈉Na2HPO4·12H2O，磷酸二氫鈉NaH2PO4·2H2O，鹽酸HCl，均為分析純；乙腈，色譜純；新制去離子水，18.3 MΩ·cm。

儀器：Ultimate3000高效液相色譜儀，美國DIONEX(戴安)公司；UV-3600紫外可見近紅外分光光度計，日本島津公司；L-12C恒溫振蕩水浴，廈門RAPID(瑞比)公司；SK7210HP超聲波清洗器，上海科導超聲儀器有限公司；PHS-3C精密pH計，上海虹益儀器儀表有限公司；MS204S電子天平，瑞士Metter Toledo公司。

1.2 染料水解實驗

在250 mL錐形瓶中加入150 mL pH=11.0的緩沖溶液(緩沖溶液由500 mL濃度為0.05 mol/L的NaHCO3和227 mL濃度為0.1 mol/L的NaOH混合后加水稀釋至1 000 mL而成)，置于恒溫振蕩水浴中，預(yù)熱至指定溫度，加入0.6 g染料，進行水解反應(yīng)。在指定的時間間隔，用移液管移取2.5 mL水解液，分置于已加入20 mL pH=6的緩沖溶液(該緩沖溶液由123 mL濃度為0.2 mol/L的Na2HPO4·12H2O和877 mL濃度為0.2 mol/L的NaH2PO4·2H2O混合而成)的25 mL容量瓶中，終止水解反應(yīng)，定容并冷卻至室溫后進行色譜分析。

2 雙鹵代均三嗪活性染料的選擇

由于具有對稱結(jié)構(gòu)的雙鹵代均三嗪活性染料在該類型染料中的比例達90%以上[5]，故本文選擇具有對稱結(jié)構(gòu)的雙鹵代均三嗪活性染料進行研究，使研究結(jié)果具有更廣泛的適應(yīng)性。對稱結(jié)構(gòu)雙鹵代均三嗪活性染料的選擇也將使實驗結(jié)果的分析和討論得到簡化，這是因為其第一步水解反應(yīng)無論發(fā)生在哪個活性基上，所得的一鹵代一羥基雙均三嗪染料形式均是相同的結(jié)構(gòu)，如果忽略染料的降解，水解反應(yīng)過程中最多只有3種物質(zhì)，即雙鹵代均三嗪染料形式a、一鹵代-羥基雙均三嗪染料形式b、雙-羥基均三嗪染料形式c，見圖1，這將避免增加分離的困難。

注：X為鹵素；Y為連接基團。圖1 對稱結(jié)構(gòu)的雙-氯均三嗪活性染料在堿性緩沖溶液中的親核取代反應(yīng)Fig.1 Nucleophilic substitution of bis(halogeno-s-trazine) reactive dye with symmetrical chemical structure in alkali buffer solution

非對稱結(jié)構(gòu)的雙鹵代均三嗪活性染料在第1步水解時將出現(xiàn)2個峰(為水解產(chǎn)物)，這2個峰在進一步的水解過程中又各自衍生出1種水解產(chǎn)物，導致整個過程有5種物質(zhì)存在。初始染料a、半水解染料b和完全水解染料c在結(jié)構(gòu)上只有1個或2個取代基的差異，它們在色譜柱中的保留時間非常接近，本身就不好分離，組分增多會使分離更加困難。

3 色譜條件的確定

3.1 色譜柱的選擇

在色譜分析方法中，色譜柱的選擇是方法成功與否的關(guān)鍵，也是提高樣品分離度的關(guān)鍵。活性染料及其水解產(chǎn)物本身均是強極性的有機化合物，不適合用正相色譜進行分離。目前使用最多的是反相離子對高效液相色譜法[6-8]，該方法已被證實對活性染料及其水解產(chǎn)物的分析是一種快速有效的方法[9-11]。在反相離子對色譜分離過程中，采用非極性的疏水固定相，含有對離子M+的甲醇-水或乙腈-水溶液作為極性流動相。流動相中待分離的活性染料離子D-與固定相或流動相中帶相反電荷的對離子M+結(jié)合，形成離子對化合物M+D-，混合物中的各組分在固定相和流動相之間進行分配，當流動相中所含混合物經(jīng)過固定相時，就會與固定相發(fā)生作用。由于各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異與固定相發(fā)生作用的大小、強弱也有差異，因此在同一推動力的作用下，不同組分在固定相中的滯留時間不同，因而按先后不同的次序從固定相中流出，達到分離的效果[12]。

反相離子對色譜在選擇色譜柱時需要考慮以下幾個方面：

1) 烷基的碳原子數(shù)：常用的反相色譜柱有C8～C18鍵合的硅膠柱，活性染料樣品均采用水溶液進行HPLC分析，鍵合的烷基鏈越長，烷基疏水作用越強，色譜柱的分離效果越好，故在活性染料分析中多采用C18鍵合的硅膠柱ODS-2。

2)色譜柱的長短和填料的粒徑：在填料和內(nèi)徑一定的情況下，色譜柱越長，分離度越大，但柱長、柱壓和樣品的保留時間也會相應(yīng)增大，這意味著系統(tǒng)要承受更高的壓力和消耗更多的流動相，因此在滿足分離要求的情況下，柱長越短越好。相同長度的色譜柱，填料的粒徑越小，理論塔板數(shù)越高，分離效果越好，故一般采用3 μm的粒徑，短柱就可達到很好的分離效果。對稱結(jié)構(gòu)的雙鹵代均三嗪活性染料及其水解產(chǎn)物，主要成分只有3種，采用長150 mm，5 μm粒徑的短柱基本可達到分離要求。

3)色譜柱的內(nèi)徑：色譜柱的內(nèi)徑越大，樣品分散程度越差(即樣品無法在到達柱頭時呈現(xiàn)均勻面狀分布)，峰的對稱性將下降，分離度變差，但內(nèi)徑大的，柱容量增大，意味著進樣體積增大。目前市場上通用的4.6 mm內(nèi)徑的色譜柱，基本能滿足活性染料色譜分離的需要。

綜上所述，對色譜柱的選擇主要看分離成分的復(fù)雜性和極性的大小。待分離成分多，最好選擇長一點的柱子，分離的成分少，建議選擇短柱，長柱不能滿足分離要求的，可以選擇更小的填料粒徑。

色譜柱確定后，還需確定相應(yīng)的流速。150 mm×4.6 mm，粒徑為5 μm的C18鍵合硅膠柱ODS-2，流速為1 mL/min，而250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm的C18鍵合硅膠柱，流速為1.5 mL/min。流速越大，系統(tǒng)壓力越高，流動相流經(jīng)色譜柱的時間越短，出峰越早。樣品出峰保留時間一般在8～15 min為宜(但有時為了提高分離的效率，也可適當縮短分離時間至6～8 min，尤其是在梯度洗脫時)。需注意的是太大的流速有時會影響樣品的分離度，因此合適的流速應(yīng)同時兼顧分離度和分離效率。

3.2 檢測器及檢測波長的選擇

雙鹵代均三嗪活性染料水解產(chǎn)物的3種形式有相同的母體結(jié)構(gòu)，在可見光區(qū)具有相近的最大吸收波長，在最大吸收波長處3種染料形式的摩爾消光系數(shù)相近，因此一般選擇紫外可見檢測器，在染料的最大吸收波長處對其進行檢測[13-14]。使用時要注意儀器的檢測限或靈敏度，樣品的進樣量應(yīng)在儀器的檢測范圍內(nèi)，避免出現(xiàn)檢不出或超限的情況，在符合儀器檢測限要求的情況下，應(yīng)盡量選擇低的樣品濃度，這樣可以提高檢測的靈敏度，峰形也會更好。

3.3 流動相的選擇

3.3.1 有機溶劑的選擇

流動相是有機溶劑和離子對緩沖溶液的混合液。活性染料HPLC分析中常用的有機溶劑是甲醇和乙腈，相對甲醇而言，雖然乙腈具有分子質(zhì)量大，黏度高，不易產(chǎn)生氣泡，洗脫能力比甲醇強等優(yōu)點，但國內(nèi)多選擇甲醇做有機相，主要是因為乙腈的價格較高，毒性較大。本實驗發(fā)現(xiàn)，以甲醇/水的體積比=70∶30對雙鹵代均三嗪活性染料及其水解產(chǎn)物進行分離，即使1 h也不能出峰，而換做乙腈/水溶液體積比=50∶50時10 min左右即能出峰，說明對雙鹵代均三嗪活性染料而言，甲醇的洗脫能力明顯不足，故選擇乙腈較為合適。

3.3.2 對離子的選擇

常用帶正電的離子對試劑有四甲基溴化銨、四乙基溴化銨和四丁基溴化銨等。離子對試劑烷基碳原子數(shù)越多，染料樣品在色譜柱上的保留越多，樣品的分離效果也越好，因此采用反相離子對液相色譜對染料樣品進行分析時，一般均采用碳原子數(shù)最多的四丁基溴化銨。對離子的濃度是控制反相離子對色譜溶質(zhì)保留值的主要因素，可在較大范圍內(nèi)改變分離的選擇性，其具體濃度需經(jīng)實驗確定。

3.3.3 洗脫體系的確定

在進行色譜分離時，設(shè)計洗脫程序的一個原則是能用等度洗脫時就不用梯度，必須采用梯度時也要盡可能用一步梯度，而不要用多步梯度，這樣可以大大提高儀器的穩(wěn)定性。對稱結(jié)構(gòu)的雙鹵代均三嗪活性染料及其水解產(chǎn)物待分離成分雖然只有3種，但由于3種物質(zhì)結(jié)構(gòu)上只相差1個原子或原子團，分子的極性相差不大，故導致3種物質(zhì)緊鄰出峰，采用梯度洗脫能較易分離。

在設(shè)計梯度時，比較快捷的方法是參照已有類似樣品的色譜方法進行實驗，在沒有現(xiàn)成方法可參照時，先進行探索性實驗，然后根據(jù)實驗結(jié)果中色譜峰的峰高、半峰寬、理論塔板數(shù)、分離度和對稱性等參數(shù)進行多次調(diào)整，最終獲得最適色譜條件。以雙一氟均三嗪活性染料活性紅LS-2G及其水解產(chǎn)物的色譜分析為例，染料在80 ℃, pH=11.0條件下水解30 min后，水解液用Acclaim C18鍵合硅膠ODS-2，5 μm, 250 mm×4.6 mm色譜柱進行分析，檢測波長為502 μm，流速為1.500 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL，紫外可見檢測器，流動相A為100%乙腈溶液，流動相B為含30%的0.025 mol/L的四丁基溴化銨的乙腈溶液和70%的0.05 mol/L的磷酸二氫銨溶液的混合液，梯度洗脫體系如表1所示。所得譜圖如圖2所示。

表1 梯度洗脫體系1Tab.1 Gradient elution system 1

色譜峰的質(zhì)量由峰高H、半峰寬W、理論塔板數(shù)N、分離度R和不對稱因子S等參數(shù)來衡量[15]。圖2中峰的參數(shù)見表2。

從表2數(shù)據(jù)可看出，3種物質(zhì)已達到完全分離，保留時間TR在7～10 min之間，不對稱因子S也在可接受的范圍內(nèi)，但峰形稍矮胖(峰高H較矮，半峰寬W較大)，理論塔板數(shù)N也有待提高。半峰寬大，意味著待分離成分的流出時間較長，應(yīng)增加有機相的比例使流動相洗脫能力增強。因出峰時間是在7 min后，故初始流動相比例不變，從7 min開始提高A∶B比例至50∶50，梯度洗脫體系2如表3所示。由梯度洗脫體系2所得色譜峰見圖3。圖3中峰的參數(shù)見表4。

圖2 由梯度洗脫體系1所得譜圖Fig.2 Chromatogram obtained from gradient elution system 1

TR/minH/mAUW/minNSR峰面積/(mAU·min)7570189920293111151143013352087434396202961380310048582384103802821503791202110937567007

表3 梯度洗脫體系2Tab.3 Gradient elution system 2

圖3 由梯度洗脫體系2所得譜圖Fig.3 Chromatogram obtained from gradient elution system 2

從圖3和表4可看出，用梯度洗脫體系2對樣品進行分析，在完全分離的情況下，3種染料出峰時間均有所提前，峰高H增加，半峰寬W減小，理論塔

表4 圖3的峰參數(shù)表Tab.4 Parameters of peaks in Fig.3

板數(shù)N增加，但并不理想。2～7 min對目標物質(zhì)的分離幾乎無影響，要分離的3個峰是在7 min后出峰，即A/B的比例為50∶50后才出峰。為縮短分析時間，從2 min開始即將梯度變化到A/B的比例為50∶50，重新進行實驗，梯度洗脫體系3如表5所示。由梯度洗脫體系3所得譜圖見圖4。圖4中峰的參數(shù)見表6。

表5 梯度洗脫體系3Tab.5 Gradient elution system 3

圖4 由梯度洗脫體系3所得譜圖Fig.4 Chromatogram obtained from gradient elution system 3

TR/minH/mAUW/minNSR峰面積/(mAU·min)544428224017615177112131336395804734400177165541022028209763474751302161365610527464825

從圖4和表6可看出，從2 min開始增加有機相的比例，3種染料出峰時間明顯縮短，峰高H明顯增加，半峰寬W減少到0.2 min以內(nèi)，理論塔板數(shù)N也增加，柱效在很大程度上得到了提高。但完全水解染料c和部分水解染料b沒有完全分開，完全水解染料峰有拖尾現(xiàn)象，其右側(cè)積分方式變?yōu)榇怪狈e分，而非底到底積分，進而影響到b峰左邊的積分方式也變?yōu)榇怪狈e分，積分面積也有相應(yīng)變化。這說明梯度變化過快，流動相洗脫能力過強，因此延長第一步梯度時間到5 min重新進行實驗梯度洗脫體系4如表7所示。由梯度洗脫體系4所得譜圖見圖5。圖5中峰的參數(shù)見表8。

表7 梯度洗脫體系4

圖5 由梯度洗脫體系4所得譜圖Fig.5 Chromatogram obtained from gradient elution system 4

TR/minH/mAUW/minNSR峰面積/(mAU·min)686725404021916324115299373907493646170202214231023508246982374738602102218310427765447

由圖5和表8可知，由梯度洗脫體系4所得各峰的峰型對稱性都較好，半峰寬W小，理論塔板數(shù)N高，是較合適的梯度程序。

對比4個梯度洗脫體系可以看出，流動相中有機相含量多，洗脫能力增強，出峰時間縮短，峰形變好，但分離度變差；有機相含量少，洗脫能力差，出峰時間增加，峰形也差。因此設(shè)計梯度時要結(jié)合各方面因素進行綜合考慮，在達到完全分離的前提下應(yīng)盡可能使峰高、理論塔板數(shù)增加，半峰寬降低。

3.4 柱溫的確定

合適的柱溫能較好地控制壓力，調(diào)節(jié)保留時間，提高分離度。采用3.3章節(jié)所確定梯度，調(diào)整柱溫在室溫、30、40、50、60℃條件下分別進樣分析，考察柱溫對分離的影響，所得各參數(shù)如表9所示。

表9 不同柱溫下峰參數(shù)表Tab.9 Parameters of peaks at different column temperatures

從表9數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，隨著柱溫升高，各物質(zhì)峰的保留時間TR均逐漸提前，這可能是由于溫度升高使化合物在兩相之間的分子運動加快引起。半峰寬W則隨著溫度升高逐漸減小，但0.2 min時的半峰寬都在可接受的范圍內(nèi)。理論塔板數(shù)N基本隨著溫度升高而增大，但在60 ℃反而變小。分離度R在室溫時較差，其他溫度下影響不大。不對稱性因子S除室溫和60 ℃較大外，其他均較好，因此30～50 ℃范圍內(nèi)均為適合的柱溫。

3.5 方法的應(yīng)用

由范德華體積、氫鍵作用力和被分離組分靜電作用力的差別決定分離的選擇性并獲得理想分離是反相離子對色譜分離的主要特征[16]。不同染料及其水解產(chǎn)物的色譜分離因其染料分子結(jié)構(gòu)間的差異，往往需要分別摸索分離的條件。但本文所述具有對稱結(jié)構(gòu)的、雙偶氮類的、雙鹵代均三嗪活性染料及其水解產(chǎn)物，應(yīng)可參考本文的分析方法，從而簡單快速地建立色譜分離的條件。

如下例所示，采用AcclaimC18鍵合硅膠柱ODS-2，5 μm，150 mm×4.6 mm，及3.3章節(jié)所述梯度洗脫體系4，檢測波長為536 nm，流速為1.000 mL/min，柱溫為30 ℃；進樣量為 20 μL；紫外可見檢測器，對雙一氯均三嗪活性染料活性紅KE-3B在90 ℃,pH=11.0條件下水解60 min后的水解產(chǎn)物進行色譜分離，獲得了較好的分離效果。所得產(chǎn)物的色譜圖見圖6。圖6中峰的參數(shù)見表10。

圖6 雙一氯均三嗪染料及其水解產(chǎn)物的色譜圖Fig.6 Chromatogram of bis(monochloro-s-trazine) reactive dye and its hydrolysates

染料形式TR/minH/mAUW/minNRSc624318496701432116322101b669774764501434932322109a715355328901440985458108

從表10數(shù)據(jù)可看出，各峰的峰高H、半峰寬W、理論塔板數(shù)N、分離度R及峰對稱性S均較好。說明該方法應(yīng)用在雙鹵代均三嗪活性染料及其水解產(chǎn)物的液相色譜分離中有一定的適用性。尤其采用150 mm長的色譜柱分離雙一氯均三嗪染料活性紅KE-3B，即使其分子質(zhì)量比雙一氟均三嗪活性染料活性紅LS-2G更大，但分離的時間卻更短，說明對稱結(jié)構(gòu)的雙鹵代均三嗪活性染料及其水解產(chǎn)物的分離在150 mm色譜柱上可達到分離效果。

4 結(jié) 論

采用本文所述色譜分離方法，具有對稱結(jié)構(gòu)的雙一氟均三嗪活性染料活性紅LS-2G及雙一氯均三嗪活性染料活性紅KE-3B及其水解產(chǎn)物均得到較好的分離效果。該分離方法的建立對其他具有類似結(jié)構(gòu)的染料或化合物的色譜分離方法的建立具有一定指導意義。參考該方法時應(yīng)注意，若使用不同牌號的色譜柱，即使標明了相同的規(guī)格，所得分析結(jié)果也可能不同，因為不同牌號的色譜柱在填充劑及填料方式上存在較大不同，即使有微小的差異也可能導致分析結(jié)果的不同，若想得到分析結(jié)果的重現(xiàn)性，也須注意填裝同一批填料，在定性分析時，最好先做比對實驗。

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Establishment of HPLC separation method for bis(halogeno-s-triazine) reactive dyes and their hydrolysates

HU Lingling1,2， FAN Xuerong1

(1.CollegeofTextile&Clothing,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China;2.CollegeofTextile&Clothing,UniversityofShaoxing,Shaoxing,Zhejiang312000,China)

In order to study the hydrolysis reaction of bis(halogeno-s-triazine) reactive dyes, the reversed-phase ion-pair high performance liquid chromatography was employed to separate the bis(halogeno-s-triazine) reactive dyes and their hydrolysis products. The establishing procedure of HPLC separation method that is appropriate for bis(halogeno-s-trazine) reactive dyes and their hydrolysis products was discussed in terms of selection of bis(halogeno-s-triazine)reactive dyes and chromatographic column, selection and optimization of mobile phase, determination of column temperature and so on. By this method the bis(monofluo-s-triazine) reactive dye Reactive Red LS-2G and bis(monochloro-s-triazine) reactive dye Reactive Red KE-3B and their hydrolysis products were separated completely.

reactive dye; bis(halogeno-s-triazine) reactive dye; hydrolysis; kinetics; HPLC

0253- 9721(2013)09- 0077- 07

2012-08-17

2012-12-11

浙江省科技廳公益技術(shù)項目(2011C21071)

胡玲玲(1977—)，女，博士生。研究方向為多組分纖維紡織品的染整加工技術(shù)及理論。范雪榮，通信作者，E-mail:wxfxr@163.com。

TS 193.632

A