BACTEC MIGT960在結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗中的臨床研究

陳忠南，趙麗麗，易松林，譚 笑，胡培磊，白麗瓊，萬康林，譚云洪

2.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所/傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室，北京 102206

結(jié)核病被列為我國重大傳染病之一，是嚴(yán)重危害人民群眾健康的呼吸道傳染病。耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)和流行已成為結(jié)核病防治領(lǐng)域的難點和關(guān)注焦點。傳統(tǒng)的藥敏試驗存在需時過長、操作復(fù)雜、不易標(biāo)準(zhǔn)化和自動化等缺點，不能為結(jié)核病的臨床治療提供及時、有價值的藥物敏感性相關(guān)資料［1］。尋求快速、準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)的藥敏診斷方法是大勢所趨。我們采用臨床分離的212株結(jié)核分枝桿菌菌株，BACTEC MIGT960與傳統(tǒng)L－J比例法檢測8種一線/二線抗結(jié)核藥的藥敏情況進(jìn)行了比較分析，結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 ，從2010年12月起連續(xù)收集8個月對就診于湖南省胸科醫(yī)院的疑似病例的痰標(biāo)本經(jīng)L－J培養(yǎng)基和MGIT960液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，陽性培養(yǎng)物復(fù)均鑒別培養(yǎng)基（PNB/TCH）進(jìn)行菌種鑒定，確診為結(jié)核病者212例。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 全自動 BA CT ECTM MGIT TM960 TB系統(tǒng)，購置于美國BD公司。（1）MGl T960用試劑分枝桿菌生長指示管 （MGIT），生長添加劑和BACTEc MGIT 960 SIRE試劑盒含SIRE添加劑和4種一線藥物：（INH、RFP、SM、EMB）均為 BD公司產(chǎn)品，4種二線藥物［CPM、KAN、OFLX、ETH）為sigma產(chǎn)品。各藥物在培養(yǎng)基的終濃度參照BD公司《MGIT操作程序指南》［2］（2）L－J方法用試劑L－J法所用對照和含藥培養(yǎng)基均為改良羅氏培養(yǎng)基，所用8種藥物，其配方和制備按文獻(xiàn)［3］配制。

1.3 藥物敏感性實驗 212例結(jié)核分枝桿菌菌株，分別用MGIT960法和L－J比例法進(jìn)行一線藥物敏感性檢測。在完成一線藥物的藥物敏感性實驗后，選取90株耐藥菌株（對任何一種一線藥物耐藥）進(jìn)行二線藥物的藥物敏感性實驗，除去任一方法污染例數(shù)進(jìn)行對比分析。

1.3.1 MGIT 960法 參照 《MGIT操作程序指南》［2］對于一線藥物藥敏試驗，每株結(jié)核桿菌準(zhǔn)備5支MGIT 960培養(yǎng)管1管為生長對照管，4管為加藥管），每管均加人0.8 m L SIRE添加劑，4支加藥管各加入SM、INH、RFP和EMB 100μL，然后，每支加藥管加入0.5 m L菌懸液（報陽當(dāng)天為第0 d，報陽第1～2 d的標(biāo)本直接加原液，3～5 d的標(biāo)本需用1∶5無菌生理鹽水稀釋），生長對照管（GCT）加1∶100無菌生理鹽水稀釋的菌懸液0.5 m L。將準(zhǔn)備好的 MGIT管按 GCT、SM、INH、RFI、EMB的順序放人AST試管架，系統(tǒng)掃描試管架條形碼，按照儀器指示位置放入BACTEC MGIT 960儀器；MGIT 960儀器會在4～13 d內(nèi)，根據(jù)Growlh unit值，自動報告耐藥與敏感結(jié)果。二線藥物藥敏試驗步驟同一線藥物，但加藥順序、試管擺放順序和所出報告的順序均為GCT、CPM、KAN、0FLX、ETH。

1.3.2 L－J比例法 參照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》［3］，一線藥物藥敏試驗與二線藥物藥敏試驗分別進(jìn)行，從報陽第4～5 d的MGIT管（報陽后需置于37℃培養(yǎng)箱）吸取適量菌液于含玻璃珠的無菌小瓶內(nèi)，漩渦振蕩幾秒鐘，以0.5%吐溫－80生理鹽水配成1個麥?zhǔn)媳葷釢舛?，并用生理鹽水稀釋至10 mg/m L和10 mg/m L的菌懸液，取稀釋好的菌懸液分別接種于對照和含藥培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，待菌落長出時觀察結(jié)果，根據(jù)耐藥百分比判別：耐藥百分比＝（含藥培養(yǎng)基的菌落數(shù)/對照培養(yǎng)基的菌落數(shù)）×100%，若耐藥百分比＞l%為耐藥（R），≤l%為敏感（S）。

1.3.3 質(zhì)量控制 一線/二線藥物藥敏實驗的質(zhì)控，在開展一線/二線藥物藥敏試驗前，首先對中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所下發(fā)的10株質(zhì)控菌株，每個菌株重復(fù)3次試驗并將試驗結(jié)果報中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，只有質(zhì)控結(jié)果符合率≥90%以上，方可開展一線/二線藥物藥敏實驗。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 試驗數(shù)據(jù)使用SPSS11.0軟件進(jìn)行分析處理：培養(yǎng)時間、采用秩和檢驗，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在分析藥敏試驗結(jié)果時，以L－J比例法為判斷標(biāo)準(zhǔn)，計算MGIT 960法的敏感度、特異性和準(zhǔn)確性，兩種方法檢測結(jié)果的一致性用Kappa檢驗判別，Kappa值≥0.75，說明兩種方法具有較好的一致性，0.75＞Kappa值≥0.4說明兩種方法的一致性一般，Kappa值＜0.4說明兩種方法的一致性不好。

2 結(jié) 果

2.1 MGIT 960法與L－J比例法對半12份標(biāo)本的藥敏結(jié)果比較，見表1。

2.2 MGIT 960法與L－J比例法檢測時間的比較MGIT 960法完成一線藥物藥敏試驗的平均時間為8d，L－J法規(guī)定判讀時間為28 d，二者的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（表2），MGIT 960法完成二線藥物藥敏試驗的平均時間為10 d，L－J法規(guī)定判讀時間為28 d，二者的差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）

（表3）。

表1 8種抗結(jié)核藥物藥敏試驗結(jié)果Tab.1 Comparison on the results between L－J proportional and MGIT960 methods for DST to 8 drugs（strain）

表2 一線藥物藥敏試驗測定所需d數(shù)Tab.2 Average time on completion of DST for the first－line drugs（day）

表3 二線藥物藥敏試驗測定所需d數(shù)Tab.3 Average time on completion of DST for the second－line drugs（day）

3 討 論

我國是結(jié)核病高耐藥國家，耐藥結(jié)核病的控制將直接關(guān)系到我國結(jié)核病控制的成效［3］。BACTEC MGIT 960是美國BD公司生產(chǎn)的全自動分枝桿菌快速培養(yǎng)、鑒定、藥敏液體培養(yǎng)分析系統(tǒng)，主要用于快速培養(yǎng)和一線藥物的藥敏檢測。目前二線藥物的敏感性診斷也被WHO認(rèn)可并在國外多家結(jié)核病參比試驗室使用［4］，國內(nèi)有些省份的結(jié)核病參比實驗室已在使用MGIT 960進(jìn)行結(jié)核桿菌的快速培養(yǎng)和一線藥敏試驗，但未見二線藥敏的開展。目前我國結(jié)核桿菌的耐藥情況形勢嚴(yán)峻，只開展一線藥物敏感試驗對復(fù)治難治的耐多藥病人來說，是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。特對MGIT960一線/二線藥物藥敏快速檢測技術(shù)做出以下評價：

（1）MGIT 960法與傳統(tǒng)的L－J比例法藥敏試驗的符合率較好。異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、卡那霉素、氧氟沙星MGIT 960法的準(zhǔn)確性和Kappa值均大于0.75，說明以上7種藥物MGIT 960法與傳統(tǒng)的L－J比例法藥敏試驗具有較好的一致性。乙硫異煙胺Kappaa值0.75＞Kappa值≥0.4，說明兩種方法的一致性一般，這與趙麗麗等［5］的試驗結(jié)果基本一致。

（2）MGIT 960法藥敏試驗的檢測時間明顯短于L－J比例法藥敏時間。MGIT 960法完成一線藥物藥敏試驗的平均時間為8 d，完成二線藥物藥敏試驗的平均時間為10 d，L－J法藥敏試驗平均時間為30 d。MGIT960法時間上提前近20多天，避免延誤病情，提高治療結(jié)核病的效率，從而有效地控制結(jié)核病及耐藥結(jié)核病的傳播。

本次臨床試驗，采用統(tǒng)一的技術(shù)方案開展研究，MGIT 960法與傳統(tǒng)的L－J比例法藥敏試驗的符合率及檢側(cè)時間結(jié)果經(jīng)與項目省之一遼寧省［6］張娟及國家參比室趙麗麗［5］等的研究比較，取得一致性效果。說明在已開展MGIT 960法一線藥敏試驗的省份，二線藥敏試驗值得推廣。

綜合上述，MGIT 960法具有快速、簡便、準(zhǔn)確等特點，缺點是儀器價格昂貴，試劑依賴進(jìn)口。在基層小規(guī)模醫(yī)院MGIT 960不太適用，但在結(jié)核病患者較多的大醫(yī)院，更適合應(yīng)用全自動的MGIT960儀器，或集中結(jié)核病患者，通過批量培養(yǎng)，也能減少患者個人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。到20世紀(jì)80年代后，結(jié)核病的病原學(xué)快速診斷才取得突破性進(jìn)展，如BACTEC法的液體快速培養(yǎng)，在歐美等發(fā)達(dá)國家已獲得認(rèn)證，成為廣泛應(yīng)用的方法［7］。

［1］Iseman MD，Heifets LB.Rapid detection of tuberculosis and drug－resistant tuberculosis［J］.N Engl J Med，2006，355（15）：1606－1608.DOI：10.1056/NEJMe068173

［2］Siddiqi SH，Rüsch－Gerdes S.MGITTMprocedure manual：Mycobacteria Growth Indicator Tube（MGIT）culture and drug susceptibility demonstration projects［M］.Geneva：Foundation for Innovative New Diagnostics，2006.

［3］Shen X，Mei J，Shen M，et al.The effect of drug resistance on treatment of tuberculosis［J］.J Chin Antituberculosis Assoc，2006，28（5）：309－312.（in Chinese）

沈鑫，梅建，沈梅，等.耐藥對肺結(jié)核病治療效果的影響.［J］.中國防癆雜志，2006，28（5）：309－312.

［4］World Health Organization.Policy guidance on drug－ausceptibility testing（DST）of second－line antituberculosis drugs［M］.Geneva：World Health Organization，2008.

［5］Zhao LL，Wan KL，Xia Q，et al.MGIT 960 and proportion method for drug susceptibility testing ofMycobacteriumtuberculosis［J］.J Med Res，2011，40（5）：40－43.（in Chinese）

趙麗麗，萬康林，夏強(qiáng)，等.MGIT 960和比例法對結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗的對比研究［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2011，40（5）：40－43.

［6］Zhang J，Jiang J，Zhang H，et al.Comparing analysis of Mycobacterium Bactec MGIT960 culture with Lowenstein－Jensen culture method［J］.Chin J Antituberculosis，2011，11（6）：361－365.（in Chinese）

張娟，蔣俊，張紅，等.MGIT960與羅氏培養(yǎng)法在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗中的比對分析［J］.中國防癆雜志，2011，11（6）：361－365.

［7］Liu XY，Lin JX，Zheng HC，et al.Evaluation of a combined technique composed of three methods on rapid diagnose of tuberculosis［J］.Mod Hosp，2011，11（7）：331－335.（in Chinese）

劉曉燕，林健雄，鄭惠聰，等.三種方法組成的結(jié)核病快速診斷技術(shù)的評價［J］.現(xiàn)代醫(yī)院，2011，11（7）：331－335.