骨髓間充質干細胞移植對慢性腦缺血大鼠海馬區Cdc42表達及認知功能的影響

于曉云 張博愛 李俊敏 劉 宇 李曉曉 崔 璨 崔紅衛

(鄭州大學第一附屬醫院神經內科，河南 鄭州 450052)

慢性腦缺血是一種能導致神經退行性疾病和嚴重記憶功能障礙的病理狀態，阿爾茨海默病、血管性癡呆、缺血性卒中均與此有關，目前干細胞治療已成為其一個有吸引力的治療策略，最常用的干細胞來源于骨髓，研究證明，骨髓間充質干細胞可以通過旁分泌作用分泌腦源性神經營養因子(BDNF)等多種神經營養因子，有效治療亨廷頓病和肌萎縮性側索硬化等神經退行性疾病〔1〕。Cdc42是細胞骨架的重要調節因子，其活化后可通過激活Arp2/3介導的肌動蛋白聚合反應，引起細胞骨架重構，調節樹突棘的生長，從而改善慢性腦缺血大鼠的認知功能，而骨髓間充質干細胞能否調控Cdc42的表達從而改善認知功能目前尚不明確。大鼠永久性雙側頸總動脈結扎(2VO)是模擬慢性腦缺血的主要方式〔2〕，且術后8～12 w是最接近人類慢性腦缺血后血流改變的階段〔3〕，故我們通過制作2VO模型產生慢性全腦低灌注，用Morris水迷宮篩選出造模成功的大鼠，分別于術后8、10、12 w檢測大鼠行為學改變，通過免疫組化和Western印跡檢測海馬區Cdc42表達的變化。

1 材料與方法

1.1 骨髓間充質干細胞提取、培養、轉染及注射 體重約150 g SD大鼠頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡5 min，分離大鼠后肢股骨、脛骨，超凈工作臺內剪開暴露骨髓腔并用全培養基反復沖洗，沖洗液移至離心管內，1 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀細胞于DMEM-F12(10%FBS)培養基中培養，密度為1×106個細胞，置于5%CO2、37℃、飽和濕度的培養箱中，2～3 d更換培養基1次。待貼壁細胞接近90%時，將細胞懸液1∶3傳代。大鼠造模1 w時取P5代細胞，從尾靜脈注射1 ml骨髓間充質干細胞單細胞懸液入老鼠體內(按細胞密度2×106個/ml)。取部分P5代骨髓間充質干細胞，待細胞長至滿瓶底的50%時更換含有攜帶綠色熒光蛋白(GFP)基因的慢病毒培養液，感染復數(MOI)為30，至細胞長滿瓶底，按上述濃度從尾靜脈移植入體內。

1.2 實驗動物及分組 購健康雄性SD大鼠(鄭州大學實驗動物中心)72只，體重450～550 g，隨機分為假手術組、2VO模型組、實驗組(2VO模型+干細胞移植組)，各組分8、10、12 w三個時間點，每個時間點8只。

1.3 動物模型的制備 采取2VO制造大鼠慢性腦缺血模型〔4〕，術前禁食12 h，禁水4 h，給予10%水合氯醛腹腔注射(0.3 ml/100 g)，仰臥位固定，頸部剪毛、消毒，取正中切口，逐步剝離出雙側頸總動脈，先后給予近心端和遠心端結扎，于兩結扎點之間剪斷頸總動脈以確保血流中斷，逐層縫合。假手術組除不結扎頸總動脈外其他操作均與模型組相同。

1.4 Morris水迷宮測試 Morris水迷宮可用于測試大鼠的空間學習記憶功能，分為隱蔽站臺實驗和空間探索實驗兩部分。每天訓練開始時將鼠任意從四個象限之一面向池壁放入水中，每次試驗鼠共游90 s尋找站臺，若成功找到，給予30 s休息時間，若未找到，引導至站臺，同樣給予30 s休息時間，共訓練4 d，每天上午2次，下午2次。隱蔽站臺實驗結束24 h后撤除平臺，將鼠從一固定象限入水，由圖像自動監視和處理系統記錄大鼠的逃避潛伏期。訓練后即手術取腦。

1.5 腦組織切片的制備及Cdc42的免疫組織化學的檢測 各組大鼠達到規定時間點后，10%水合氯醛麻醉，仰臥位固定備皮，剪開胸部皮膚暴露心臟，在左心耳處刺一小口引流血液，在主動脈弓插一針頭灌注4%多聚甲醛，直至大鼠后肢繃直，尾部豎起成一直線，開顱取腦，將其放入4%多聚甲醛中過夜，石蠟包埋后4 mm連續切片，取海馬區觀察。采用山羊超敏二步法行免疫組化檢測，依次烤片、脫蠟水化、0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液95℃水浴15 min，H2O2室溫避光封閉10 min，一抗(sc-6083美國Santa Cruz公司)以1∶75濃度4℃過夜，生物素二抗(PV-9003北京中杉金橋)室溫孵育20 min，DAB(北京中杉金橋)顯色，鏡下控制反應時間，蘇木素復染后鹽酸酒精分化，脫水透明、中性樹膠封片。用PBS液代替一抗設立陰性對照。用倒置顯微鏡觀察Cdc42的陽性細胞數并計數，在400倍視野下計數5個不重復視野中的陽性細胞個數，取平均值。

1.6 Cdc42蛋白樣品的制備及Western印跡檢測 各組大鼠達到規定的時間點后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，俯臥位固定，快速開顱取腦，于冰上解剖取出海馬，小組織剪剪碎，以1 ml/100 mg加組織裂解液RIPA(R0010北京索寶萊科技公司)，冰上研磨30 min，12 000 r/min 4℃離心，取上清，加上樣緩沖液100℃變性10 min，－20℃保存備用。

Western印跡檢測:用聚丙烯酰胺電泳獲得Cdc42蛋白，濃縮膠6%，電壓80 V，分離膠12%，電壓100 V，半干轉至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，一抗1∶500過夜，二抗(IH-0051北京鼎國昌盛)1∶1 000，ECL(CW-0049北京康為世紀)顯色，暗室曝光，定影、顯影。以β-actin(CW-0096北京北京康為世紀)作為內參對照，掃描膠片后以目的蛋白的灰度值與內參的灰度值比值進行統計分析。

1.7 統計學分析 用SPSS17.0軟件進行統計學分析，檢測數據的正態性和方差齊性，用單因素方差分析和兩兩比較t檢驗，所有的結果用x±s表示。

2 結果

2.1 骨髓間充質干細胞培養、轉染及移植結果 見圖1。

圖1 骨髓間充質干細胞

2.2 水迷宮測試結果 如表1所示，假手術組大鼠潛伏期無統計學差異(P＞0.05)，隨時間的延長模型組和實驗組大鼠潛伏期均逐漸延長(P＜0.05)，相同時間點，實驗組大鼠較模型組大鼠潛伏期縮短(P＜0.05)。

2.3 免疫組織化學測試結果 DAB染色結果如圖2所示:假手術組大鼠海馬區神經元數量豐富，三個時間點無明顯差異(P＞0.05)，模型組大鼠海馬區神經元變性壞死、數量缺失明顯增多，且隨著時間延長程度逐漸加重(P＜0.05)，實驗組海馬區神經元變性壞死、細胞缺失程度較模型組明顯減輕(P＜0.05)，隨時間延長細胞缺失程度逐漸加重(P＜0.05)。見表2。

2.4 Western印跡測試結果 如圖3所示:假手術組Cdc42蛋白表達無明顯差異，模型組蛋白表達明顯減少，且隨時間延長逐漸降低，實驗組蛋白表達較模型組增高，與水迷宮及免疫組化結果一致。見表3。

表1 大鼠在水迷宮試驗中的平均逃避潛伏期(x ± s，n=8)

表2 大鼠海馬CA1區陽性細胞數(x ± s，n=8)

表3 各組大鼠海馬Cdc42蛋白Western印跡相對灰度值(x ±s，%，n=8)

圖2 各組大鼠海馬CA1區Cdc42的表達(DAB，×400)

圖3 海馬區蛋白Cdc42的Western印跡檢測結果

3 討論

慢性腦缺血是引起認知功能障礙最常見的原因之一，在2VO慢性腦缺血模型中，腦組織通過一系列損傷級聯反應引起神經元及神經突觸的進行性減少。神經突觸，尤其是興奮性突觸是認知功能的基礎，大多數興奮性突觸位于神經元樹突棘(樹突表面的小突起)的尖端。大腦海馬區在維持認知及記憶功能中起著至關重要的作用，2VO模型中，海馬區神經元減少尤為嚴重，從而影響大鼠學習和記憶功能〔5〕。Cdc42是Ras超家族中小分子量G蛋白成員之一，具有GTP酶活性，在大鼠的海馬、小腦、丘腦、大腦皮層均有表達〔6，7〕，Cdc42 被激活后可調控神經元的形態和極化活動，包括細胞的分裂、遷移，軸突發芽、生長和伸長率，以及再生和突觸可塑性〔8〕，其調控路徑是多樣的，例如:與GTP結合的Cdc42可通過與WASP及其亞型的相互作用參與調節肌動蛋白的聚合和絲狀偽足的形成〔9〕，活化的Cdc42可聯合活化的PAKs通過絲氨酸/蘇氨酸激酶LIMK1途徑改變細胞骨架〔10〕，其通過PAR蛋白家族調節小鼠皮質和海馬區結構的形成及細胞分化、星形膠質細胞突觸生長方向〔11，12〕。通過以上途徑均可調控海馬神經元樹突棘的生長，進而改善大鼠的記憶及認知功能。

間充質干細胞是中胚層細胞的基質前體細胞，可從幾乎所有結締組織中分離，具有易于獲取、來源豐富、沒有明顯移植排斥反應等優點，在神經系統疾病治療中具有巨大應用前景。本實驗通過觀察骨髓間充質干細胞移植后慢性腦缺血大鼠海馬區Cdc42的變化，發現隨著時間的延長，大鼠海馬區Cdc42表達逐漸減少，空間認知功能逐漸下降，而干細胞移植組大鼠Cdc42的表達均比相對應時間點2VO模型組多，且大鼠認知功能均有改善，說明骨髓間充質干細胞移植后可通過某種途徑提高Cdc42的表達，調控樹突棘的生長，進而改善神經系統的發育、損傷后修復、學習、記憶等多種功能。我們推測，干細胞移植后可通過旁分泌途徑分泌BDNF等多種神經營養因子，通過其 TrkB 受體，磷酸化 Ephrin-B，進而活化 EphB2〔13〕，EphB2 活化Cdc42后，通過上述途徑調控樹突棘的生長，改善慢性腦缺血大鼠的認知功能障礙。

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