河南漢族原發性高血壓患者MTHFR基因C677T多態性位點檢測

姚 蕊 張會敏 張俊蕾 李冬貝 范陽陽

(新鄉醫學院護理學院，河南 新鄉 453003)

近年來，同型半胱氨酸(Hcy)已被證實是心腦血管疾病的獨立危險因子，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是 Hcy代謝的關鍵酶之一，該基因C677T位點突變與各種心腦血管疾病的關系的研究較多，但存在分歧〔1～4〕，而與原發性高血壓(EH)的關系研究尚不多見。本研究采用病例對照研究的方法，收集(EH)患者150例和與之年齡及性別匹配的對照150例，對MTHFR基因C677T多態性進行檢測，探討二者的相關性。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2008年10月至2010年10月在新鄉醫學院第一附屬醫院住院150例EH患者作為病例組，選取年齡、性別相匹配的150例同期住院患其他疾病患者或體檢中心健康志愿者作為對照組。病例組患者均符合WHO關于EH的診斷標準，即收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg，年齡52～78歲，平均年齡(63.4±6.32)歲，男87例，女63例。排除繼發性高血壓、心臟病、糖尿病、腎臟病等患者。對照組年齡51～81歲，男85例，女65例。兩組在性別、年齡、收入、吸煙、飲酒等方面匹配，沒有統計學差異(P＜0.05)。

1.2 方法

1.2.1 一般資料問卷調查 采用自編問卷，調查兩組性別、年齡、收入、吸煙、飲酒等一般情況。

1.2.2 一般生化指標、葉酸和同型半胱氨酸的檢測 采用全自動生物化學分析儀測定總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、空腹血糖(FPG)數值。采用化學發光法測定也葉酸水平。應用高效液相色譜(HPLC)法測定血液中Hcy:采用Agilent1100液相色譜儀，色譜柱為 Hypersil C18柱(46 mm，250 mm，5 m);流動相為0.04 mol/L醋酸緩沖液，流速0.8 ml/min;進樣量20μl;柱溫25℃;分析時間15 min;熒光檢測條件:激發波長382 nm，發射波長470 nm。樣本兩次測定值誤差不超過15%。Hcy正常值設定在＜10 mol/L，超過10 mol/L定義為高同型半胱氨酸血癥(HHcy)〔2〕。

1.2.3 DNA的提取和濃度測定 抽取每名患者空腹外周靜脈血4 ml于EDTA抗凝管中，存放于－20℃冰箱中。集中提取DNA。用人全血DNA提取試劑盒(購于德國BMS公司)提取DNA后，存放于－20℃ 。用核酸蛋白濃度測定儀測定抽提基因組DNA濃度，并將保存的基因組模板DNA原液用 DNA溶解液稀釋(GEN TRA公司Puregene試劑盒)至終濃度為5～10 ng/μl。

1.2.4 MTHFR基因型測定 采用聚合酶鏈式反應限制性酶切片段長度多態性分析法，擴增引物序列如下:上游 5'-CAAAGGCCACCCCGAAGC-3'和下游5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。反應體系25μl:1 mmol/L MgCl2、dNTP 200μmol/L、正反引物各0.5μmol/L、TaqDNA聚合酶2 U、模板DNA 5μg。PCR擴增條件如下:94 ℃5 min，94 ℃30 s，56 ℃40 s，72 ℃ 40 s，35 個循環，末次延伸7 min;取8μl PCR反應產物，加4 U限制性內切酶 HinfⅠ，反應體積20μl，酶切4 h。取8μl酶切產物，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，溴乙啶(EB)染色30 min，UVP凝膠成像系統攝像判斷基因型。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統計分析，計量資料進行非配對t檢驗及方差分析，計數資料和Hardy-Weinberg平衡檢驗均采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 兩組生化指標、葉酸、Hcy水平比較 兩組血糖、血脂相比，沒有統計學差異(P＞0.05)病例組葉酸水平低于對照組(P＜0.05)，病例組Hcy水平明顯高于對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組血糖、血脂水平比較(x±s)

2.2 病例組和對照組MTHFR基因型和等位基因頻率比較由圖1可見，PCR擴增產物片段為246 bp，HinfⅠ酶切結果顯示MTHFR基因型有3種，分別為野生型(C/C)、雜合子型(C/T)、純合子突變型(T/T)，包含C等位基因的246 bp的片段不被HinfⅠ酶切，含T等位基因的片段被HinfⅠ酶切為174 bp和72 bp的兩個片段。病例組MTHFR(C677T)基因CC基因型頻率分別為21.3%、CT基因型頻率為46.0%、TT基因型頻率為32.7%，T等位基因頻率為55.7%，C等位基因頻率為44.3%;對照組MTHFR(C677T)基因CC基因型頻率分別為40.7%、CT基因型頻率為44.7%、TT基因型頻率14.6%，T等位基因頻率為37.0%，C等位基因頻率為63.0%。見表2。

圖1 PCR-RFLP電泳結果

表2 病例組和對照組MTHFR(C677T)基因型和等位基因頻率〔n(%)〕

3 討論

高血壓分為EH和繼發性高血壓，在大多數患者中，高血壓的病因不明，稱為EH，占高血壓總數的95%以上。關于高血壓發病機制的研究主要從環境和遺傳兩個方面，有研究表明MTHFR基因C677T多態性與高血壓關系密切〔4，5〕，并且與血漿中Hcy水平關系密切，但因為不同種族、不同地區高血壓的發病率也有明顯的差異，且河南豫北地區高血壓的發病較高，且沒有其與MTHFR基因C677T多態性的研究，因此我們從一般資料進行問卷調查，并進行生化指標的檢測，發現EH與血糖、血脂水平無關，而與Hcy水平關系密切，病例組Hcy平均水平明顯高于對照組，且葉酸水平明顯低于對照組。我們的研究結果支持Hcy是心血管疾病的獨立危險因素的傳統觀點，Hcy代謝過程中有一個關鍵酶就是MTHFR，因此越來越多的人開始關注Hcy水平與MTHFR基因多態性的關系，且大多集中在C677T位點，但研究結果并不一致，有研究表明該位點突變可引起Hcy水平升高〔6〕，國外的研究也有相同的觀點。這與國外研究結果一致〔7〕，但也有報道認為 Hcy水平與 MTHFR基因C667T多態性無相關性〔8〕。本研究結果顯示，病例組T等位基因和T/T型分布頻率均高于對照組，提示C677T突變與河南豫北地區漢族人群EH發生有著密切關系，可能是其發病的遺傳危險因素之一。

1 Sacoo RL，Adams R，Albers G，et al.Guidelines for prevention of stroke in patients with ischemic stroke or transient ischemic attack:a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association Council on Stroke:cosponsored by the Council on Cardiovascular Radiology and Intervention:the American Academy of Neurology affirms the value of this guideline〔J〕.Stroke，2006;37(2):577-617.

2 Trabetti E.Homocysteine，MTHFR gene polymorphisms，and cardio cerebrovascular risk〔J〕.JAppl Genet，2008;49(3):267-82.

3 Nahar，Akash Sabo，Cynthia CPNP，et al.Plasma homocysteine levels，methylene tetrahydrofolate reductase polymorphisms，and the risk of thromboembolism in children〔J〕.J Pediatric Hematol Oncol，2011;33(5):330-3.

4 王 紅，武貴臻，張 穎，等.新疆哈薩克族人群同型半胱氨酸及其代謝酶基因多態性與原發性高血壓的關系〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2010;14(33):6247-52.

5 宗永華，李小鷹，陳光亮，等.同型半胱氨酸水平與N5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性的關系〔J〕.臨床心血管病雜志，2011;27(3):203-7.

6 宗永華，徐希平，霍 勇，等.影響安慶農村地區H型高血壓發生的遺傳和環境因素〔J〕.中華高血壓雜志，2011;19(5):445-9.

7 Gueantrodriguez RM，Juilliere Y，Candito M，et al.Association of MTRR A66G polymorphism(but not of MTHFR C677T and A1298C，MTR A2756G，TCN C776G)with homocysteine and coronary artery disease in the French population〔J〕.Thromb Haemost，2005;94(3):510-5.

8 Muniz MT，Siqueira ER，Fonseca RA，et al.Evaluation of MTHFR c677t gene polymorphism and homocysteine level in coronary atherosclerotic disease〔J〕.Arq Bras Endocrinol Metabol，2006;50(6):1059-65.