降鈣素對兔膝骨性關節炎軟骨細胞凋亡及相關基因的影響

尤笑迎 楊紅梅

(鄭州人民醫院骨科，河南 鄭州 450003)

膝骨性關節炎(KOA)是以滑膜和關節軟骨結構破壞和功能障礙為主要病理改變的慢性退行性骨關節疾病，是導致關節疼痛、畸形的主要原因，嚴重影響老年人的生活質量，研究發現其發生、發展與軟骨細胞的凋亡有關〔1〕。本實驗通過建立不穩定膝關節誘導骨性關節炎模型，觀察了降鈣素對KOA發病過程中關節軟骨細胞凋亡和相關基因的影響，從而探討降鈣素治療KOA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 鮭魚降鈣素(1 ml:50 U/支，H20050501，北京諾華制藥有限公司);生物顯微鏡(日本，OLYMPUS);TUNELL檢測試劑盒(上海銳聰科技發展有限公司);bcl-2免疫組化試劑盒(武漢博士德生物制劑有限公司)。

1.2 模型制備及實驗分組 4～6月齡健康大耳白兔36只，體質量2.5～3.0 kg，雌雄不限，隨機分為空白對照組(A組)、模型組(B組)、降鈣素治療組(C組)，每組12只。B、C兩組采用改良Hulth法復制膝骨性關節炎，經耳緣靜脈緩慢推注50%乙醇(5 ml/kg)進行麻醉，左下肢膝關節及周圍備皮、消毒，取膝關節內側入路，切斷內側副韌帶，摘除內側1/3半月板，切斷前交叉韌帶，避免損傷關節軟骨，縫合關節囊及皮膚，A組除切開皮膚和關節腔外，不做其他處理。術后連續7 d青霉素20萬U肌肉注射，分籠飼養，1 w后開始每天強迫活動1 h，連續4 w，從術后第6周開始C組每天皮下注射降鈣素5 U/kg，A、B組給予等量生理鹽水皮下注射。

1.3 軟骨標本的制備 實驗結束后，經耳緣靜脈空氣栓塞處死動物，立即切開膝關節腔，用銳利刀片切取股骨內髁關節軟骨，修成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，經冰生理鹽水沖洗后置入4%多聚甲醛液(pH 7.4)固定72 h，15%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣12周，石蠟包埋，常規切片備用。

1.4 檢測指標

1.4.1 軟骨組織大體形態觀察 動物處死后，打開關節腔，觀察膝關節關節囊、滑膜、關節軟骨及關節液是否清澈，按Pelletier JP標準進行評分，0分:關節面透明光整、色澤正常;1分:關節面粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗;2分:關節面糜爛，軟骨缺損深達軟骨表層和中層;3分:關節面有潰瘍，缺損深達軟骨深層;4分:軟骨剝脫，軟骨下骨質暴露。

1.4.2 顯微鏡下觀察 切片進行常規HE(蘇木素-伊紅)染色，顯微鏡下觀察軟骨形態變化，并參照Mankin改良的關節軟骨病理評分標準進行積分統計。

1.4.3 軟骨細胞凋亡情況檢測 采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的原位末端平移法(TUNEL)檢測軟骨細胞的凋亡情況，嚴格按試劑盒說明書進行操作。光鏡下以細胞核中出現棕黃色顆粒為陽性，每張切片隨機選取5個不重疊高倍視野，計算陽性細胞百分數。

1.4.4 軟骨組織bcl-2蛋白表達情況檢測 采用免疫組織化學染色法進行，嚴格按試劑盒說明書進行操作，用PBS代替一抗作為陰性對照，陽性結果為軟骨細胞質呈棕褐色或棕黃色顆粒，HPIAS-1000高清晰彩色病理圖像分析系統(同濟千屏)測定陽性細胞的灰度值，取每張切片均值作為測量值。

1.5 統計學處理 采用SPSS11.0統計軟件包進行統計分析，計量資料以x±s表示，用 t檢驗。

2 結果

2.1 一般情況 造模過程中，動物良好無死亡，術后膝關節感染2只，均被淘汰，列入觀察的共34只，A組11只，B組11只，C組12只，余動物實驗期間健康狀況良好。術后3～5 d膝關節腫脹較明顯，關節腔積液，雙后肢力量減低，活動頻次減少，1 w后逐漸好轉，B、C組動物膝關節不穩，有異常活動度，4 w后膝關節畸形腫大，A組關節外部結構正常，無腫脹，活動自如。

2.2 大體形態觀察 A組關節軟骨半透明狀，外觀呈藍白色，色澤明亮，無裂紋及軟化，關節液清亮透明，滑膜無增生;B組關節軟骨失去原有光澤，表面粗糙，呈灰黃色，有軟骨缺損，尤以股骨內髁明顯，滑膜不同程度增生粘連，關節液增多、混濁，呈泡沫狀;C組關節軟骨色澤變淡，光澤度降低，滑膜可見少量增生，關節液略增多。各組股骨髁軟骨退變評分見表1。

表1 各組股骨髁軟骨退變分級(n)

2.3 光鏡觀察結果 A組關節軟骨4層結構清晰可辨，軟骨面平滑規整，結構正常無裂隙，軟骨細胞排列整齊，未見軟骨細胞簇，基質均勻，潮線完整;B組軟骨表層變薄、粗糙，裂隙較多，有軟骨細胞簇集現象，潮線多不完整或消失;C組軟骨4層結構可辨，軟骨表面較規則、裂隙少，軟骨細胞排列較整齊，潮線尚完整，見圖1，Mankin評分見表2。

圖1 各組關節軟骨光鏡觀察結果(HE，×200)

2.4 軟骨細胞凋亡及bcl-2蛋白表達情況檢測結果 A組偶見軟骨細胞凋亡，B組軟骨全層可見大量凋亡的軟骨細胞，C組軟骨細胞凋亡情況介于前兩者之間。見圖2和表2;bcl-2蛋白表達情況見圖3和表2。

表2 各組Mankin評分、軟骨細胞凋亡及bcl-2蛋白表達情況(x±s)

圖2 各組關節軟骨細胞凋亡情況(TUNELL法，×200)

圖3 各組關節軟骨細胞bcl-2表達情況(DAB，×200)

3 討論

細胞凋亡是生理或病理情況下，通過基因調控的細胞死亡形式之一。研究發現正常關節軟骨中有細胞凋亡的發生，認為正常軟骨中發生凋亡現象是細胞生長與分化過程中的一種生理現象，另有研究發現軟骨細胞的凋亡過度是關節軟骨退變發展成骨關節病的重要原因，關節軟骨的細胞凋亡參與了骨關節炎的發病〔2〕。細胞凋亡受基因的調控，bcl-2是抑制細胞凋亡的重要基因，Erlacher等〔3〕在轉錄和蛋白水平研究OA患者及健康成人關節軟骨中bcl-2的表達發現，OA患者bcl-2 mRNA表達水平較高，鄰近軟骨缺損區的軟骨細胞高表達bcl-2蛋白，認為機體通過上調Bcl-2表達保護軟骨細胞免遭凋亡。

本實驗采用Hulth法復制動物OA模型，通過改變膝關節生物力學狀態以誘導關節軟骨退變，建立骨關節炎模型，通過Pelletier JP軟骨組織大體評分和改良的Mankin關節軟骨病理評分進行嚴格評價，發現與A組相比較，B組JP和Mankin評分明顯升高，而此兩種評分是反映骨關節炎病變嚴重程度的定量分析方法，病變越重，分值越大，積分越高，說明軟骨損傷越嚴重，因此該實驗結果表明B組動物膝關節軟骨破壞嚴重，同時軟骨細胞凋亡百分數和bcl-2表達均明顯升高(P＜0.05)，與Lin等〔4〕研究結果一致，說明本實驗KOA動物模型復制成功，且軟骨細胞凋亡參與了KOA發病過程，而bcl-2表達的增多則可能是KOA過程中機體自身的一種保護機制。

降鈣素是一種抗再吸收藥物，長期以來一直用于治療骨質疏松，且證實了其治療骨量減少疾病的有效性和安全性，并且可影響OA關節損傷的進程〔5，6〕。本研究提示CT對KOA具有治療作用，可減輕關節軟骨的損傷;同時發現，與B組相比，軟骨細胞凋亡百分數明顯減少，而bcl-2表達則進一步明顯升高(P＜0.05)，說明降鈣素可能通過上調bcl-2的表達調控軟骨細胞異常凋亡，而達到治療KOA的作用，至于其具體的信號轉導途徑有待進一步研究。

1 Ryu JH，Shin Y，Huh YH，et al.Hypoxia-inducible factor-2α regulates Fas-mediated chondrocyte apoptosis during osteoarthritic cartilage destruction〔J〕.Cell Death Differ，2011;211(10):1038-45.

2 Musumeci G，Loreto C，Carnazza ML，et al.Characterization of apoptosis in articular cartilage derived from the knee joints of patients with osteoarthritis〔J〕.Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2011;19(2):307-13.

3 Erlacher L，Maier R，Ullrich R，et al.Differential expression of the pro-tooncogene bcl-2 in normal and osteoarthritic human articular cartilage〔J〕.Rheumatol，1995;22(5):926.

4 Lin MN，Liu XX，Wang SL，et al.Effect of OA knee pad on apoptosis genes Bcl-2 and p53 expression in articular cartilage cells of experimental knee osteoarthritis〔J〕.Zhongguo Gu Shang，2009;22(9):688-91.

5 Segovia-Silvestre T，Bonnefond C，Sondergaard BC，et al.Identification of the calcitonin receptor in osteoarthritic chondrocytes〔J〕.BMC Res Notes，2011;4(1):407-13.

6 Nielsen RH，Bay-Jensen AC，Byrjalsen I，et al.Oral salmon calcitonin reduces cartilage and bone pathology in an osteoarthritis rat model with increased subchondral bone turnover〔J〕.Osteoarthritis Cartilage，2011;19(4):466-73.