腹腔和皮下注射D-半乳糖衰老大鼠模型分析

姜國良 于 曉 徐 愷 劉 云

(中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003)

目前，人類衰老方面的研究，多采用建立衰老動物模型的方法。衰老動物模型分為自發性衰老動物模型和實驗性衰老動物模型。實驗性與自發性相比可控性強，易于回溯，縮短建模時間降低建模成本，優化實驗流程。目前，可以利用3種方法構建衰老動物模型，其中 D-半乳糖注射法最常用〔1，2〕。D-半乳糖是一種衰老誘導劑。它是一種由六個碳和一個醛組成的單糖，歸類為醛糖和己糖。D-半乳糖誘導建立衰老動物模型多采取腹腔和皮下注射D-半乳糖兩種方法。但是對兩種注射方法所建立的衰老動物相關指標的差異一直未見報道〔3〕。本實驗分別采用皮下和腹腔注射D-半乳糖兩種方法構建衰老動物模型，通過胸腺和脾臟指數、血液及組織生化指標檢測、組織切片觀察討論兩種模型間的差異，為實驗動物模型建立的標準化提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 D-半乳糖(國藥集團化學試劑有限公司)，葡萄糖測定試劑盒，C反應蛋白(CRP)測定試劑盒，丙二醛(MDA)測定試劑盒，總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒，單胺氧化酶(MAO-B)測試盒，測定試劑盒均購自南京建成科技有限公司，其余配置試劑均為普通市售分析純。

1.2 實驗動物 3月齡雄性Wistar大鼠(SPF級)30只，體重174 g±5.3 g，購自山東魯抗醫藥股份有限公司，合格證號:SCXLC魯20080002。動物房溫度(22±2)℃，濕度(60±15)%。自然光照。飼喂大鼠飼料，購自山東魯抗醫藥股份有限公司。

1.3 實驗分組和操作 適應1 w后開始實驗。將30只大鼠隨機分為空白組10只，腹腔注射組10只，皮下注射組10只。利用 D-半乳糖0.125 g·kg－1·d－1連續腹腔和皮下注射40 d。皮下注射部位均為右后大腿內側。末次給藥后24 h，分別稱量3組老鼠的體重，摘眼球取血，離心取血清。另分別取胸腺，脾臟，腹部皮膚和腦組織。稱取胸腺和脾臟重量，皮膚和腦組織一部分在－20℃低溫保藏，另一部浸泡Bouin固定液固定，準備進一步制作切片。

1.4 指標測定

1.4.1 計算胸腺指數和脾臟指數 根據稱量所得的體重，胸腺重量和脾臟重量計算胸腺指數和脾臟指數。

1.4.2 血液及組織生化指標測定 血清葡萄糖，CRP，MDA，T-SOD，GSH-Px含量，皮膚羥脯氨酸含量以及腦B型單MAO-B含量測定均按照測試盒說明書進行，采用分光光度法。

1.4.3 組織切片制作 選取浸泡改良Bouin固定液固定腦和皮膚組織，制作常規石蠟切片，切片厚度6μm，HE染色后在Nikon顯微鏡下觀察、拍照。

1.5 統計學分析 各組實驗數據均用SPSS13.0統計軟件做統計學處理。所得結果均以x±s表示，并做單因素方差分析。

2 結果

2.1 大鼠胸腺指數和脾臟指數 在胸腺指數上，皮下注射組、腹腔注射組與空白組相比均顯著下降(P＜0.01)。皮下注射組與腹腔注射組之間無明顯差異，但表現出一定的下降趨勢。在脾指數上，皮下注射組、腹腔注射組與空白組相比均沒有顯著差異(P＞0.05)。皮下注射組與腹腔注射組之間也沒有顯著差異，僅表現下降趨勢。見表1。

表1 不同注射組大鼠的胸腺指數和脾臟指數(x ± s，n=10)

2.2 血液生化指標 在血糖含量上，三組之間沒有明顯差異(P＞0.05)。CRP含量上，腹腔注射組、皮下注射組與空白組相比均顯著升高(P＜0.01)，皮下注射組與腹腔注射組相比明顯升高(P＜0.05)。在MDA含量上，腹腔注射組、皮下注射組與空白組相比均顯著升高(P＜0.01)，腹腔注射組與皮下注射組相比明顯升高(P＜0.01)。T-SOD和GSH-Px活性上，腹腔注射組、皮下注射組與空白組相比均明顯降低(P＜0.01)，腹腔注射組與皮下注射組相比活性降低更加顯著(P＜0.01)。見表2。

表2 不同注射組大鼠血液生化指標(x ± s，n=10)

2.3 組織生化指標 在腦MAO-B活性上，皮下注射組、腹腔注射組與空白組相比均顯著升高(P＜0.01)，皮下注射組與腹腔注射組相比無明顯差異，僅表現下降趨勢。在皮膚羥脯氨酸含量上，腹腔注射組和皮下注射組與空白組相比均顯著降低(P＜0.01)，皮下注射組與腹腔注射組相比明顯降低(P＜0.05)。見表3。

表3 不同組大鼠的組織生化指標(x ± s，n=10)

2.4 皮膚組織切片 空白組皮膚厚度正常，表皮角質層完整，基底層細胞排列整齊。腹腔注射組表皮厚度明顯變薄，表皮細胞結構改變且數量明顯下降，基底層細胞少數出現空泡，整體排列仍較整齊。皮下注射組皮膚厚度進一步變薄，表皮有部分缺失，基底層細胞嗜堿性降低，排列疏松紊亂;真皮彈力纖維增粗，堆積，排列不規則。見圖1。

2.5 腦組織切片 空白組大腦白質內神經元細胞體清晰可見，結構正常。腹腔注射組大腦白質和皮下注射組大腦白質內神經元細胞體胞質不清晰，樹突和軸突縮短消失。腹腔注射組和皮下注射組間差異不大。空白組大腦灰質內神經纖維排列緊密，結構正常。腹腔注射組大腦灰質內神經元細胞腫脹，但數量仍較多。皮下注射組大腦灰質內神經元纖維排列疏松，神經細胞數量明顯減少。見圖2。

圖1 各組皮膚組織切片(HE，×400)

圖2 各組大鼠大腦白質與灰質病理圖片(HE，×400)

3 討論

D-半乳糖導致機體衰老的主要機制是:通過連續注射使D-半乳糖在機體細胞內累積。細胞內的醛糖還原酶可以將其還原成無法被細胞代謝的半乳糖醇。胞內堆積的半乳糖醇可以影響細胞的滲透壓，使細胞腫脹，進而使細胞功能障礙、代謝紊亂，最終導致機體衰老〔4〕。本實驗表明，兩種注射方法所建立的衰老大鼠模型在各項血液生化指標上均有衰老體現，衰老大鼠模型已經建立。

衰老機體內較高含量的還原糖可與蛋白質、脂類、核酸等大分子中的游離氨基發生非酶促糖基化反應。其通過加成反應產生的早期產物經重排、脫水形成帶熒光的棕色化合物，即晚期糖基化終末產物AGEs。AGEs隨年齡增長不斷積累，從而促進機體衰老〔5〕。通過試驗比較，腹腔注射和皮下注射D-半乳糖沒有引起衰老大鼠血糖升高，與以往的實驗結果一致〔6〕。其原因可能是注射劑量和時間不足〔7〕。

體內C反應蛋白水平能夠對機體的健康及衰老狀況起到警示作用〔8〕。實驗結果顯示，兩種衰老大鼠模型的CRP水平較空白組明顯升高，說明衰老機體正處于不健康狀態。這可能與各器官、免疫系統等功能性衰退有關。皮下注射組的CRP水平較腹腔注射組較高可能是由于皮下注射D-半乳糖延長了D-半乳糖對機體的作用時間，從而使機體對非健康狀態更加敏感。

衰老的自由基學說認為體內產生過多的氧自由基會將不飽和脂肪酸氧化成超氧化物，從而形成脂褐素。過多的氧自由基還會破壞細胞膜，使蛋白質和酶變性，從而加速衰老。氧化物含量和抗氧化酶的活性是評價機體氧化水平的主要指標。MDA是自由基與脂質中不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應所產生的過氧化脂質的分解產物。因此，MDA的含量可以反映過氧化程度，從而反映衰老程度。超氧物歧化酶(SOD)和GSHPx是機體內重要的清除自由基的抗氧化酶，可以作為衰老的直觀指標。試驗中，兩種衰老大鼠模型較空白組高的MDA含量，較低的T-SOD和GSH-Px的活性反映了機體的衰老狀態。即，自由基的累積和抗氧化酶活性的降低，與以往實驗結果一致〔9〕。皮下注射組的MDA含量較腹腔注射組高，但腹腔注射組T-SOD和GSH-Px的活性較皮下注射組更低，表現出兩種衰老大鼠模型在自由基代謝上的差異。說明腹腔注射D-半乳糖建立的衰老大鼠模型的自由基代謝水平較皮下注射組差，自由基的累積程度較高。因此，在進行自由基代謝相關領域的研究時，選取腹腔注射D-半乳糖建立衰老大鼠模型可能會取得更加顯著的效果。本文結果說明注射D-半乳糖可以使免疫系統功能下降，但是在兩種衰老大鼠模型間差異不大。這個結果與徐智等〔10〕的研究結果一致。

腦MAO-B在衰老機體內的累積可以導致兒茶酚胺類神經遞質的減少，使大腦的反應和思維活動遲緩，是衰老的重要指標。實驗結果顯示腹腔注射組，皮下注射組MAO-B活性與空白組相比明顯升高，而腹腔注射組與皮下注射組相比略有升高。腦組織切片的結果也顯示了這一點。從初步構建腦衰老模型的角度出發，注射D-半乳糖可以起到一定的效果，且腹腔注射的效果好一些。

皮膚羥脯氨酸含量的下降可以顯示真皮內膠原蛋白含量的降低，從而反映衰老程度〔11〕。實驗結果顯示腹腔注射組，皮下注射組與空白組相比皮膚羥脯氨酸含量明顯下降，而皮下注射組與腹腔注射組明顯降低。這與皮膚組織切片的結果一致。說明，皮下注射D-半乳糖的吸收途徑對皮膚的作用更加直接。因此，從實驗結果可見，在皮膚衰老模型的研究中，皮下注射D-半乳糖效果明顯優于腹腔注射D-半乳糖構建的大鼠模型，可以應用于該領域模型的構建。

腹腔注射和皮下注射D-半乳糖構建的衰老大鼠模型，兩種方法均可建立穩定可靠的衰老大鼠模型，且兩種模型均能在多層面上反映出機體的衰老情況。從應用角度出發，腹腔注射D-半乳糖構建的大鼠模型較皮下注射D-半乳糖構建的大鼠模型在機體應激研究、自由基代謝研究、腦衰老研究中有較好的效果。而皮下注射D-半乳糖構建的大鼠模型較腹腔注射D-半乳糖構建的大鼠模型在皮膚衰老模型的研究中效果更突出。

本文發現，注射D-半乳糖構建衰老大鼠模型，腹腔注射的方法要比皮下注射方法造模效果更加明顯。這種差別可能是因為腹腔注射法是將D-半乳糖注射入腹腔胃腸道漿膜以外，腹膜以內。由于腹膜的面積廣大且密布血管和淋巴管，因此腹膜有很強的吸收能力，每小時可吸收動物體重3% ～8%的液體，因而對血液指標的影響更大。皮下注射D-半乳糖則是將D-半乳糖推入皮下結締組織，D-半乳糖經皮下結締組織間的毛細血管、淋巴管吸收進入血液循環，因而對皮膚組織和羥脯氨酸含量的影響更大。兩種不同的注射方法導致大鼠機體對D-半乳糖的藥代動力學差異，而藥代動力學上的差異是導致兩種衰老大鼠模型之間差異的主要原因。

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