2型糖尿病大鼠胰島素抵抗與視黃醇結(jié)合蛋白4的相關(guān)性

朱麗麗 于 健 蘇 珂 胡 璟 何永玲

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西 桂林 541001)

胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病(T2DM)的病理生理基礎(chǔ)，也是其發(fā)病的始動(dòng)因素，貫穿于T2DM的發(fā)生、發(fā)展全過(guò)程，如何改善IR成為治療糖尿病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。目前發(fā)現(xiàn)脂肪組織是一個(gè)活躍的內(nèi)分泌器官，通過(guò)分泌大量的脂肪細(xì)胞因子參與糖、脂代謝調(diào)節(jié)的過(guò)程，主要有抵抗素、白介素-6、腫瘤壞死因子-α、瘦素等，脂肪細(xì)胞因子與IR存在密切聯(lián)系〔1〕。視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)作為一種近年被證實(shí)的與肥胖誘導(dǎo)的IR相關(guān)的脂肪細(xì)胞因子，在T2DM發(fā)病機(jī)制尤其是IR中受到廣泛關(guān)注〔2〕。本研究擬通過(guò)觀察血清RBP4在T2DM大鼠IR的水平，進(jìn)一步探討血清RBP4與IR及脂代謝的關(guān)系及相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠30只，10周齡，體重200～220 g，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為:SCXK(桂)2007-0001，在桂林醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，每籠4～5只，室溫控制在(22±2)℃，相對(duì)濕度控制在40% ～60%，明暗周期為12 h(8 am～8 pm)，均自由取食飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備 注射用鏈脲佐菌素由美國(guó)Sigma公司提供;血清RBP4(大鼠)檢測(cè)試劑盒由上海藍(lán)基公司提供;胰島素(大鼠)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter Inc公司;3-15型臺(tái)式低速離心機(jī)由德國(guó)Sigma公司提供;7600型全自動(dòng)生化分析儀由瑞士羅氏公司提供;血糖檢測(cè)由瑞士羅氏公司卓越型快速血糖儀及血糖試紙?zhí)峁?/p>

1.3 飼料 普通飼料由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;蛋黃粉、豬油、白糖均自備;高脂飼料配方:普通飼料60%、豬油17%、白糖20%、蛋黃粉3%，上述成分均勻混合，重新壓制成形。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物模型建立與分組 以高脂高糖飼料喂養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素(STZ)左下腹腔注射(ip)的方法建立T2DM大鼠IR模型。將30只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組15只、模型組15只。正常對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)8 w。每日添食、換水一次，觀察大鼠的皮毛、色澤、精神狀態(tài)、食欲、尿量等一般情況，每周固定時(shí)間測(cè)量大鼠血糖、體重。8 w末，所有大鼠隔夜禁食12 h，自由飲水，正常對(duì)照組給予1次性ip 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液30 mg/kg，模型組給予1次性 ip 1%STZ溶液30 mg/kg(STZ溶于0.1 mol/L檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液中，pH 4.2)。正常對(duì)照組繼續(xù)普通飲食，模型組繼續(xù)高糖高脂飲食72 h后檢測(cè)隨機(jī)血糖，以連續(xù)2次隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L作為T(mén)2DM大鼠模型成功判定標(biāo)準(zhǔn)〔3〕，模型組共有12只大鼠造模成功，兩組大鼠飲食同前，繼續(xù)喂養(yǎng)4 w。

1.4.2 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.2.1 一般情況 觀察毛色、神態(tài)、精神、體重等，記錄動(dòng)物死亡情況。

1.4.2.2 生化指標(biāo)測(cè)定 12 w末，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有大鼠禁食12 h，于次日8時(shí)斷尾采血，羅氏血糖儀檢測(cè)空腹血糖(FBG)，再予10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈采血8 ml，3 000 r/min離心 10 min，收集血清，從中取 1.5 ml血清置－20℃冰箱保存，以備RBP4的檢測(cè)。采用全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀測(cè)定血漿總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的含量，采用自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定空腹胰島素(FINS)。胰島素抵抗采用穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估法:胰島素敏感指數(shù)(ISI)和胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，公式:ISI=Ln〔1/(FBG×FINS)〕，HOMA-IR=FINS×FBG/22.5。

1.4.2.3 RBP4的測(cè)定 血清RBP4用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定:取出酶標(biāo)板，每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl，再在各孔中加入50μl酶結(jié)合物溶液，混勻，將酶標(biāo)板用封口膠密封后，37℃孵育1 h，充分洗滌酶標(biāo)板5次，用吸水紙徹底拍干，各孔中加入顯色劑100μl，25℃避光反應(yīng)15 min，最后各孔加入終止液50μl，終止反應(yīng)，30 min內(nèi)在波長(zhǎng)450 nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的吸光度(A值)處吸光值，用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與A值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的A值代入方程式，計(jì)算出各樣品RPP4的濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用x±s表示，同一時(shí)間點(diǎn)兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，血清RBP4水平與各變量間的關(guān)系采用Pearson分析和多元逐步回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠一般情況的比較 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后的8 w內(nèi)兩組大鼠攝食量基本持平，大鼠的活躍程度和毛色光亮無(wú)明顯變化，8 w后，模型組大鼠較正常對(duì)照組大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)粗糙發(fā)黃無(wú)光澤、多飲、多食、多尿、消瘦等表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)期間正常對(duì)照組大鼠死亡1只，模型組大鼠3只造模不成功。

2.2 兩組大鼠體重的比較 同一時(shí)間點(diǎn)與正常對(duì)照組相比，除實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，前8 w的模型組大鼠體重均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);造模后模型組大鼠體重較正常對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。正常對(duì)照組大鼠在實(shí)驗(yàn)期間體重一直呈顯著的增長(zhǎng)趨勢(shì)，模型組大鼠在前8 w體重亦呈明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)，在8 w后體重較前顯著下降的趨勢(shì)，兩組大鼠喂養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)體重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=819.836，P=0.000)，飼料干預(yù)和體重之間存在交互效應(yīng)(F=78.727，P=0.000)。見(jiàn)表 1。

2.3 兩組大鼠實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的比較 建模開(kāi)始時(shí)兩組大鼠斷尾測(cè)FBG，正常對(duì)照組為(4.92±0.60)mmol/L，模型組為(5.19±0.86)mmol/L，兩組大鼠建模初空腹血糖比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型組大鼠 FBG、FINS、TG、TC、LDLC、HOMA-IR水平及RBP4水平均明顯高于正常對(duì)照組大鼠，ISI低于正常對(duì)照組大鼠(P＜0.05，P＜0.01)。見(jiàn)表2。

表2 兩組大鼠RBP4水平及實(shí)驗(yàn)指標(biāo)比較(x±s)

2.4 血清RBP4與其他指標(biāo)的相關(guān)性 簡(jiǎn)單相關(guān)分析顯示，模型組大鼠血清RBP4與FINS(r=0.453，P＜0.05)、FBG(r=0.816，P ＜ 0.01)、TG(r=0.733，P ＜0.01)、TC(r=0.699，P ＜0.01)、LDL-C(r=0.747，P ＜ 0.01)、HOMA-IR(r=0.817，P ＜0.01)正相關(guān)，與ISI(r=－0.770，P＜0.01)負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步以血清 RBP4 為因變量，以 FINS、FBG、TG、TC、LDL-C、HOMA-IR和ISI為自變量進(jìn)行多元逐步回歸分析，結(jié)果顯示，HOMA-IR是血清RBP4獨(dú)立影響因素(r2=0.668，β=0.237，P＜0.01)。

3 討論

IR指胰島素作用的靶器官(主要是肝臟、肌肉和脂肪組織)對(duì)胰島素作用的敏感性降低，從而導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生一系列病理變化，進(jìn)而演變?yōu)門(mén)2DM。本研究首先為準(zhǔn)確建立2型糖尿病胰島素抵抗大鼠模型，采用國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的T2DM建模方法〔4〕。有研究表明長(zhǎng)期高糖飲食，加重胰島分泌胰島素的代謝負(fù)荷，對(duì)于糖尿病前期或糖尿病人群均有不利的影響〔5〕。另外，未經(jīng)過(guò)提煉的動(dòng)物油脂可降低胰島素敏感性，誘發(fā)IR。本研究在基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上加用白糖、豬油和蛋黃粉持續(xù)喂養(yǎng)8 w后，模型組大鼠出現(xiàn)了肥胖、胰島素抵抗的特點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上再予腹腔注射小劑量STZ后，大鼠的血糖急劇升高，提示大鼠胰島功能受到高糖高脂誘導(dǎo)的IR和STZ的破壞后，胰島功能受到損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型組大鼠出現(xiàn)明顯的精神萎靡、毛發(fā)粗糙、多飲、多尿、消瘦等表現(xiàn)，且FBG、HOMA-IR水平均明顯高于正常對(duì)照組，ISI明顯低于正常對(duì)照組，表明T2DM大鼠IR模型建立成功。

由GLUT4介導(dǎo)的葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是脂肪和肌肉等組織利用葡萄糖的限速步驟。Yang等〔6〕學(xué)者發(fā)現(xiàn)，敲除了小鼠體內(nèi)的Glut4基因后，在小鼠的肌肉和肝臟部位出現(xiàn)對(duì)胰島素的抵抗性。利用 DNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，adipose-Glut4-/-型小鼠血清RBP4水平明顯升高，提示RBP4可能參與IR的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病組大鼠血清RBP4水平顯著高于正常對(duì)照組，相關(guān)分析顯示RBP4與FBG、FINS及HOMA-IR呈正相關(guān)，與ISI成負(fù)相關(guān);多元逐步回歸分析顯示，HOMA-IR為RBP4的獨(dú)立影響因素，進(jìn)一步證實(shí)了RBP4與IR的密切相關(guān)性。RBP4致IR的機(jī)制可能為:①Yang等〔6〕發(fā)現(xiàn)RBP4抑制肌肉組織磷脂酰肌醇3激酶的活性，抑制胰島素受體底物-1的磷酸化，使肌肉組織攝取葡萄糖減少;②RBP4誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸激酶不僅促進(jìn)基礎(chǔ)狀態(tài)糖異生，同時(shí)又可降低胰島素抑制肝糖輸出的作用，從兩方面共同作用導(dǎo)致組織表現(xiàn)為IR;③此外，張黎軍等〔7〕研究發(fā)現(xiàn) RBP4可能通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體氧化應(yīng)激參與IR。

脂質(zhì)代謝紊亂為糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管病變等IR相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的前期因素。新近研究發(fā)現(xiàn)RBP-4不僅參與糖代謝調(diào)節(jié)，而且與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，尤其TG〔8〕。張博等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)血清RBP4可能通過(guò)增強(qiáng)血管內(nèi)膜氧化應(yīng)激并影響血脂代謝。本研究提示RBP4可能參與了T2DM患者的脂代謝紊亂，并參與了IR相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。綜上所述，本研究成功制作T2DM大鼠IR動(dòng)物模型，模型組大鼠血清RBP4水平顯著升高，相關(guān)分析顯示 RBP4與HOMA-IR正相關(guān)，且HOMAIR為RBP4的獨(dú)立影響因素，這為RBP4與IR之間存在密切關(guān)系提供新的支持。RBP4可能通過(guò)多種途徑直接或間接參與IR的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)而增加糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，這為我們治療IR相關(guān)疾病提供一個(gè)新思路，即可以通過(guò)對(duì)RBP4進(jìn)行早期干預(yù)，從而阻止或延緩糖尿病、肥胖癥、非酒精性脂肪肝、代謝綜合征、心血管疾病等IR相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。

1 Rabe K，Lehrke M，Parhofer KG，et al.Adipokines and insulin resistance〔J〕.Mol Med，2008;14(11-12):741-51.

2 Galic S，Oakhill JS，Steinberg GR.Adipose tissue as an endocrine organ〔J〕.Mol Cell Endocrinol，2010;316(2):129-39.

3 王保偉，李 穎，劉曉紅，等.高脂飼料喂養(yǎng)時(shí)間及鏈脲佐菌素劑量對(duì)實(shí)驗(yàn)型2型糖尿病大鼠造模的影響〔J〕.衛(wèi)生研究，2011;40(1):99-102.

4 Reed MJ，Meszaros K，Entes LJ，et al.A new rat model of type2 diabetes:the fat-fed，streptozotocin-treated rat〔J〕.Metabolism，2000;49(11):1390-4.

5 Schulze MB，Schulz M，Heidemann C，et al.Carbohydrate intake and incidence of type 2 diabetes in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition(EPIC)-Potsdam Study〔J〕.Br J Nutr，2008;99(5):1107-16.

6 Yang Q，Graham TE，Mody N，et al.Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes〔J〕.Nature，2005;436(7049):356-62.

7 張黎軍，黃從新，郝亞榮，等.胰島素抵抗大鼠視黃醇結(jié)合蛋白4骨骼肌磷脂酰肌醇3激酶的表達(dá)及吡格列酮的干預(yù)作用〔J〕.中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2011;30(9):774-8.

9 Hermsdorff HH，Zulet MA，Puchau B，et al.Association of retinol-binding protein-4 with dietary selenium intake and other lifestyle features in young healthy women〔J〕.Nutrition，2009;25(4):392-9.

10 張 博，張黎軍.視黃醇結(jié)合蛋白4在糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血清中的表達(dá)及意義〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010;30(4):515-7.