曲美他嗪后處理與缺血后處理對大鼠再灌注心肌保護(hù)作用的對比

阮圣斐 周大亮 趙學(xué)忠 睢大員 于小風(fēng) 曲紹春 江一川

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院心血管疾病診治中心，吉林 長春 130021)

心肌缺血再灌注損傷是在各種原因?qū)е滦募⊙汗嘧⒘繙p少引起心肌缺血性損傷的基礎(chǔ)上，恢復(fù)血流后缺血性損傷進(jìn)一步加重，甚至出現(xiàn)不可逆性損傷的現(xiàn)象。2003年，Zhao等〔1〕提出缺血后處理的概念后，大量的臨床實(shí)驗已經(jīng)證實(shí)后處理可減輕再灌注損傷〔2〕。近年來人們發(fā)現(xiàn)在心肌再灌注開始時應(yīng)用某些藥物進(jìn)行后處理也可以實(shí)現(xiàn)相似的效果〔3〕。本實(shí)驗嘗試應(yīng)用曲美他嗪(TMZ)進(jìn)行藥物后處理，并對比觀察曲美他嗪后處理和缺血后處理對心肌的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性、清潔Wistar大鼠40只，體重230～270 g，合格證號:SCXK-(吉)2003-0001，購自吉林大學(xué)動物實(shí)驗中心。

1.2 試劑及儀器 BX51光學(xué)顯微鏡(日本 Olympus);JEM-1200EX型透射電子顯微鏡(日本);RM-2145型石蠟切片機(jī)(徠卡公司);DR-HW-1電熱恒溫水溫箱(北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠);COBAS-FARA自動生化分析儀(瑞士Roche公司);曲美他嗪片劑(法國施維雅公司)。

1.3 實(shí)驗分組及給藥 將40只Wistar大鼠按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、曲美他嗪組、缺血后處理組。假手術(shù)組只開胸心臟穿針但不結(jié)扎;心肌缺血再灌注模型參照文獻(xiàn)〔4〕方法稍加改進(jìn)，開胸結(jié)扎前降支，造成缺血30 min后，松開絲線恢復(fù)冠狀動脈血流，再灌注120 min;曲美他嗪組于再灌注前60 min灌胃曲美他嗪10 mg/kg，使再灌注時血藥濃度達(dá)峰值;缺血后處理組缺血30 min后解開絲線再灌注30 s、再結(jié)扎30 s，循環(huán)3次后持續(xù)再灌注120 min。

1.4 梗死面積測量 每組取5只大鼠取血后剖取心臟，用生理鹽水洗凈心腔內(nèi)積血，去掉心房組織及脂肪，稱重，將左心室心肌橫切4～5片，然后浸入氯化硝基四氮唑藍(lán)(NB-T)磷酸緩沖液中，置37℃恒溫水浴，待染色完全后取出，正常組織染色，缺血組織不染色。切下缺血心肌稱重，用缺血心肌與左心室濕重的百分比計算梗死面積。

1.5 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 其余5只大鼠取血后剖取心臟，取心尖相應(yīng)心肌組織制備成1 mm3標(biāo)本，置入2.5%戊二醛磷酸緩沖液固定液中，備電鏡采集圖像。同時將余下左心室環(huán)切塊，10%中性甲醛緩沖液中固定，備HE染色、鏡檢并采集組織圖像。

1.6 血清心肌酶測定 各大鼠自腹主動脈取血2～3 ml置于離心管，靜置 30 min，離心12 min(4℃，3 000 r/min)，取上清液以COBAS-FARA自動生化分析儀檢測血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 實(shí)驗數(shù)據(jù)以x±s表示，采用組間比較t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 曲美他嗪后處理對心肌梗死面積的影響 假手術(shù)組未見缺血及梗死區(qū)，曲美他嗪組〔(12.73±2.0)%〕與缺血后處理組〔(11.76±3.1)%〕差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，兩組與模型組〔(18.42±4.1)%〕比較差異顯著(P＜0.05)。

2.2 曲美他嗪對心肌組織形態(tài)學(xué)的影響 HE染色光鏡下顯示:假手術(shù)組心肌細(xì)胞大小、結(jié)構(gòu)正常，排列規(guī)則，細(xì)胞界限清晰;模型組心肌細(xì)胞腫脹，界限不清，間隙增大，心肌纖維間充滿大量紅細(xì)胞或中性粒細(xì)胞浸潤;曲美他嗪組與缺血后處理組的形態(tài)變化較模型組均有不同程度改善。見圖1。

2.3 曲美他嗪后處理對心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 假手術(shù)組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)基本正常，其余各組均有不同程度損傷，以模型組損傷最為嚴(yán)重，曲美他嗪后處理及缺血后處理組損傷較輕。見圖2。

2.4 曲美他嗪后處理對心肌酶學(xué)的影響 與模型組相比，曲美他嗪組和缺血后處理組CK、LDH、AST活性均明顯降低(P＜0.05)，曲美他嗪組與缺血后處理組之間差異不顯著(P＞0.05)。見表1。

圖1 各組心肌組織形態(tài)學(xué)改變(HE，×100)

圖2 各組心肌組織超微結(jié)構(gòu)(×25 k)

3 討論

心肌缺血再灌注損傷的概念1960年首次由Jennings等〔5〕提出，半個世紀(jì)以來，伴隨著臨床上PTCA、PCI、CABG等治療技術(shù)的廣泛應(yīng)用，其危害越來越受到人們的關(guān)注。Zhao等〔1〕在結(jié)扎犬左冠狀動脈前降支60 min后，給予重復(fù)3次的30 s再灌/30 s缺血的循環(huán)，然后再恢復(fù)冠脈血流，觀測到心肌梗死面積減小，從而提出了缺血后處理的方案;隨后，大量的臨床實(shí)驗已經(jīng)證實(shí)這種經(jīng)典的后處理方法有明確的心臟保護(hù)作用〔2〕。故本實(shí)驗中采用這種經(jīng)典的后處理方式建立缺血后處理組的模型。

近年來隨著對后處理研究的增多，人們逐漸嘗試在心肌再灌注開始時應(yīng)用某些藥物以模擬后處理機(jī)制，并取得了相同或相似的心肌保護(hù)作用〔3〕。曲美他嗪是歐洲心臟學(xué)會專家組建議中惟一提到具有潛在的抗心絞痛的代謝藥物，也是目前惟一經(jīng)臨床多中心研究證實(shí)有抗心絞痛作用的代謝藥物，故本實(shí)驗嘗試應(yīng)用曲美他嗪進(jìn)行藥物后處理，觀察其是否對再灌注心肌具有保護(hù)作用。

實(shí)驗結(jié)果顯示應(yīng)用曲美他嗪進(jìn)行后處理后，相對于再灌注模型組，可使大鼠心肌梗死面積減少，血清AST、LDH、CK活性不同程度的降低，心肌組織形態(tài)損傷有較大程度的減輕，心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷也有較大程度的減輕，其效果與經(jīng)典的缺血后處理效果相當(dāng)，顯示曲美他嗪后處理同樣可以減輕心肌的再灌注損傷。

再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制目前認(rèn)為主要是自由基增多和鈣超載所引起〔6〕。自由基增多可以使線粒體膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，使線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，并破壞膜上離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白〔7〕;鈣超載則可以促進(jìn)自由基生成，并且能加重細(xì)胞內(nèi)酸中毒，還可以激活多種磷脂酶，破壞細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)。而TMZ可選擇性抑制線粒體酶-長鏈3-酮酰輔酶A硫解酶(KAT)〔8〕，直接抑制細(xì)胞內(nèi)耗氧過多的脂肪酸β-氧化途徑，間接增加葡萄糖氧化分解，從而利用有限的氧，維持 ATP的產(chǎn)生，保證心臟的收縮功能〔9〕;并且可以提高自由基清除酶活性，抑制氧自由基對膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的各種膜結(jié)構(gòu)，減少細(xì)胞內(nèi)酶的漏出〔10〕;同時還能減輕線粒體內(nèi)鈣聚積，抑制Ca2+積聚引起的線粒體腫脹，維持線粒體功能〔11〕。在本次實(shí)驗中，通過光鏡及電鏡的觀察，顯示TMZ后處理通過上述可能的機(jī)制減輕了細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，尤其是線粒體結(jié)構(gòu)的損傷，使瀕死心肌細(xì)胞得以存活，最終減小了心肌梗死面積，降低了心肌酶的釋放。臨床上隨著介入治療的廣泛開展，使得開通冠脈的同時進(jìn)行曲美他嗪后處理成為可能，且簡便易行，值得進(jìn)一步推廣。但此種方式仍需更多動物實(shí)驗以及臨床實(shí)驗的研究證實(shí)其可靠性和安全性。

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