VEGF121-DFF40融合蛋白原核表達、純化及體外抗腫瘤活性

張 晶 梁小亮 黃連江 袁玉濤 孫紅琰

(廈門市第二醫(yī)院檢驗科，福建 廈門 361021)

理想的腫瘤治療制劑應能選擇性誘導腫瘤細胞終末分化，使其徹底失去潛在的生長能力，且對正常細胞無毒性作用。血管內皮生長因子(VEGF)，屬 PDGF家族〔1〕，其中 VEGF121方式的不同可能特異的與VEGFR-2結合〔2，3〕，而惡性腫瘤新生血管內皮細胞高表達VEGFR-2;DFF40又稱DNA斷裂因子40(DFF40)從小鼠淋巴細胞胞質中分離得到的Caspase依賴的脫氧核糖核酸酶(CAD)，二者合稱為CAD/DF40，它被認為可能是DNA降解過程中的主要核酸內切酶〔4〕。本研究旨在探討DFF40與VEGF121結合對新生血管內皮細胞的凋亡作用。

1 材料與方法

1.1 質粒與菌株 大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α、BL21(DE3)均購自博大泰克公司;PET28a菌株由本室保存;PGEM-T載體購自Promega公司。

1.2 試劑、細胞株 Trizol試劑購自Invitrogen公司;AMV RT、PGEM-T載體、PCR產物純化試劑盒及Random引物購自Premega公司;dNTP購自上海生工;RNAsin Ribonuclease抑制劑、Tag DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、Nde1、Not1酶均購自TaKaRa公司;質粒小量提取試劑盒購自Sigma公司，DMEM購自Gibco公司;MTT試劑購自美國Amresco公司;DMSO購自Sigma公司;HL-60細胞及HUVEC細胞購自協(xié)和醫(yī)科大學基礎所細胞中心，肝癌細胞取自武警總醫(yī)院。

1.3 實驗方法

1.3.1 重組表達載體的構建 分別克隆VEGF121基因、DFF40基因，并相連接，VEGF121-DFF40與PGEM-T載體連接，4℃過夜，連接產物轉化DH5α，挑菌，鑒定，陽性的克隆送測序。選測序正確的克隆提取質粒，進行Nde1、Not1雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，連接 PET28a載體，4℃過夜，轉化DH5α，挑菌鑒定，將陽性的克隆放大培養(yǎng)提取質粒，轉化大腸桿菌BL21(DE3)。

1.3.2 誘導表達 將轉化大腸桿菌BL21(DE3)的菌進行放大培養(yǎng)，至 OD值為0.6左右時，加入 IPTG至終濃度為1 mmol/L，進行誘導表達，做聚丙烯酰胺凝膠電泳。按不同的IPTG濃度及不同的誘導時間篩選最佳表達參數。大量誘導表達，離心收菌，用含10 mmol/L咪唑的裂解液進行懸菌，加入去氧膽酸鈉及溶菌酶、PMSF，混勻放置30 min，再冰浴下超聲至液體不再黏稠，4℃離心，分別收集上清和沉淀，將沉淀用洗液懸起來，分別取上清和沉淀進行電泳，進行目的蛋白表達形式的分析，證實主要以包涵體形式表達。

1.3.3 純化 洗包涵體用1M尿素洗3次，每次洗完進行超聲，用6M鹽酸胍溶解包涵體，用含50 mmol/L Tris、0.8 mol/L L-arg、2 mmol/L GSH 、0.4 mmol/L GSSG、20 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA的復性液進行稀釋復性，用含10 mmol/L咪唑的平衡液進行透析，過親和層析柱，得到純化的蛋白。進行Western印跡分析，方法按常。

1.3.4 體外實驗 用M199培養(yǎng)液培養(yǎng)HepG2細胞，HUVEC細胞，取對數生長期細胞制成單細胞懸液，調細胞濃度為2×104/ml。將兩種細胞加入96孔培養(yǎng)板中，每孔50μl，實驗孔加入蛋白終濃度分別為100、75、50、25 μg/ml，對照組加入 PBS，各設3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)。每孔加入5μg/ml的MTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔內培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100μl，震蕩搖勻10 min，使結晶物充分溶解。利用酶標儀在595 nm波長處測定各孔的吸光度(A)值，計算細胞生長抑制率(IR)，并繪制生長曲線。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0軟件，不同濃度蛋白對腫瘤的影響采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。數據以x±s表示。

2 結果

2.1 基因克隆 瓊脂糖凝膠電泳結果表明，分別在500 bp左右及700 bp左右出現條帶，與預期結果一致，DNA序列分析結果與文獻報道的序列均一致。如圖1。

2.2 重組質粒 取測序正確的雙酶切產物與表達載體PET28a(+)連接獲得的質粒p-VD，轉化產物進行PCR鑒定，得到了陽性克隆提取質粒用Nde1及Not1雙酶切可得1 200 bp片段，提示構建成功。見圖2。

2.3 融合蛋白在大腸桿菌中表達 將轉化大腸桿菌BL21(DE3)的菌落挑取斑進行誘導表達，加入 IPTG濃度為1 mmol/L，誘導4 h，如圖3，可看到明顯表達帶。

2.4 純化及Western印跡結果 用Ni-NTA柱進行純化，得到了非常純的目的蛋白見圖4，將表達產物進行SDS-PAGE后電轉到硝酸纖維素膜上，作Western印跡，結果得到在44 000 D附近的條帶，與結果相符，見圖5。

2.5 MTT法細胞毒性測定結果 見表1。融合蛋白對兩種細胞的直接作用與PBS組均有顯著性差異(P＜0.01)，提示此融合蛋白對兩種細胞均有直接殺傷作用。當蛋白濃度是25μg/ml時對肝癌細胞的直接作用與PBS組無顯著性差異(P＞0.05)，其余各組均有顯著性差異，說明從50μg/ml起對腫瘤細胞有直接作用，抑制率約為5%，蛋白濃度是100μg/ml時抑制率為6.5%;而HUVEC組則每個蛋白濃度均與PBS組有顯著性差異(P＜0.01)，其抑制率為42%，而當蛋白濃度是100μg/ml時抑制率為71%，明顯高于肝癌細胞組。

表1 不同濃度融合蛋白體外直接細胞毒作用OD(x±s)

圖1 DFF40及VEGF基因PCR擴增

圖2 p-VD酶切質粒電泳圖 圖3 融合蛋白的表達

圖4 純化的融合蛋白

圖5 融合蛋白的Western印跡

3 討論

目前，惡性腫瘤仍然是威脅人類生命的重大隱患之一，我們期待一種特效抗腫瘤藥物的出現。血管內皮生長因子作為內皮細胞特異的有絲分裂原〔5，6〕，在血管發(fā)生和形成過程中起重要的調節(jié)作用，VEGF在腫瘤的血管形成和維持中也起著重要作用，與腫瘤的生長、轉移、預后關系密切，正因為如此，越來越多的研究將VEGF及其受體作為靶點用于腫瘤的治療。

本研究利用VEGF與DFF40結合的這種特點，成功克隆了目的基因并在大腸桿菌中表達，摸索出一套純化蛋白的方法，并證明其在體外對肝癌細胞及人臍靜脈血管內皮細胞均有殺傷作用，故它作為一種融合蛋白很有可能成為殺傷惡性腫瘤血管內皮細胞的重要物質，為今后大量生產、研究其生物學活性以及將來基因工程藥物的研發(fā)奠定了基礎。

1 Neafeld G，Tessler S，Gitag-Goren H，et al.Vascular endothelial growth faetor and its receptors〔J〕.Prog Growth Fact Res，1994;5(12):89-95.

2 Folkman J，Shing Y.Angiogenesis〔J〕.J Biol Chem，1992;267(4):10931-45.

3 Brooks PC.Cell adhension molecules in angiogenesis〔J〕.Cancer Metastasis Rev，1996;15(6):187-92.

4 Harper SJ，Bates DO.VEGF-A splicing:the key to anti-angiogenictherapeutics〔J〕?Nat Rev Cancer，2008;8:880-7.

5 Konishi S，Ishiguro H，Shibata Y，et al.Decreased expression of DFF45/ICAD is correlated with a poor prognosis in patients with esophageal carcinoma〔J〕.Cancer，2002;95(12):2473-8.

6 Widlak P，Lanuszewska J，Cary RB，et al.Subunit structures and stoichiometries of human DNA fragmentation factor proteins before and after induction of apoptosis〔J〕.JBiol Chem，2003;278(29):26915-22.