SHH信號通路在血管平滑肌細胞增殖和凋亡中的作用

孫愛萍 程曉曙

(南昌大學第二附屬醫院，江西 南昌 330006)

血管平滑肌細胞(VSMC)的異常增殖是包括動脈粥樣硬化在內的血管增殖性疾病的共同病理基礎〔1〕。動脈粥樣硬化有著較高的致病率和致死率，是一類嚴重威脅人類健康的疾病〔2〕。動脈粥樣硬化的病理變化包括脂質聚集、單核-巨噬細胞的侵入、泡沫細胞形成、炎癥及 VSMC增生等〔3〕。其中，VSMC的過度增殖被認為是促進動脈粥樣硬化發生發展的一個關鍵因素。國外有研究表明，Hedgehog(HH)信號通路的激活可促進創傷后微血管內皮細胞的增殖和抑制其凋亡，有利于損傷毛細血管的修復〔4〕。國內研究顯示，SHH通路啟動因子重組SHH可促進海水浸泡血管內皮細胞增殖和抑制其凋亡，證實SHH信號通路通過作用于血管內皮細胞而促進毛細血管的修復〔5〕。本研究通過體外培養VSMC，并采用SHH信號通路特異抑制劑環巴胺(Cyclopamine)進行干預，研究SHH信號通路在VSMC增殖中的作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍動脈VSMC株，由中國科學院細胞中心提供;DMEM培養基、胎牛血清，由美國Hyclone公司提供;Cyclopamine，由美國Biomol公司提供;二甲基亞砜(DMSO)，由美國Sigma公司提供;四甲基偶氮唑藍(MTT)、碘化丙啶(PI)，由上海生工生物工程技術服務有限公司提供。ELITEESP型流式細胞儀，由美國Coulter公司提供;Multicycle分析軟件，由美國Phoenix公司提供。

1.2 VSMC的培養 將VSMC接種在含10%胎牛血清、雙抗(100 U/ml青霉素和100 g/ml鏈霉素)的高糖DMEM培養液中，然后于37℃、飽和空氣濕度和5%CO2條件下在孵箱內進行培養。經0.25%胰酶+0.2%乙二胺四乙酸(EDTA)消化傳代，3 d傳1代，實驗用第4～5代細胞。

1.3 MTT方法測定細胞增殖 傳代細胞融合生長至80%左右時經消化后調整細胞懸液濃度至5×104/ml，接種于96孔板，每孔加200μl懸液。各培養孔加入Cyclopamine，終濃度分別為0.625、1.25和2.5μmol/L。以酒精(Cyclopamine的溶媒)作為空白對照，終濃度為0.1%。上述細胞分別培養12、24 h和48 h時，每孔加入5 mg/ml MTT 20μl。繼續培養4 h后加入DMSO顯色。最后用酶標儀檢測各孔吸光度(A值)。每孔設定5個復孔，取其均值作為最終測量值。細胞增殖抑制率(%)=1-δA 值實驗孔/× δA 值對照孔100%。

1.4 流式細胞術檢測細胞周期和凋亡 按MTT實驗操作，各培養孔加入Cyclopamine，終濃度分別為1.25和2.5μmol/L，培養24 h和48 h。消化收集各組細胞，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，用4℃無水乙醇固定30 min，離心，染色30 min后采用流式細胞檢測儀檢測細胞周期，檢測結果經Multicycle軟件分析。凋亡指數(AI)=亞二倍峰細胞數/總細胞數×100%，增殖指數(PI)=(S期 +G2/M期)(G0/G1期 +S期 +G2/M期)×100%。

1.5 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行分析，計量資料以x±s表示。

2 結果

2.1 Cyclopamine對增殖指數和AI的影響 在培養液中加入不同濃度Cyclopamine后，VSMCPI降低，AI升高。見表1。

表1 Cyclopamine對增殖指數和AI的影響(x±s)

2.2 Cyclopamine對細胞增殖的影響 在培養液中加入不同濃度Cyclopamine后，平滑肌細胞的增殖均受到抑制，并且抑制作用呈濃度及時間依賴性。見表2。

2.3 Cyclopamine對細胞周期的影響 在培養液中加入不同濃度Cyclopamine后，VSMC中處于G0/G1期的比例升高，而處于S期和G2/M期的比例降低。見表3。

表2 Cyclopamine對細胞增殖的影響(x±s)

3 討論

目前對動脈粥樣硬化發病原因尚未完全確定，可能與年齡、性別、血脂異常、高血壓、吸煙、糖尿病、肥胖、感染等因素有關〔6〕。近年來的觀點認為動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病，VSMC過度增殖被認為是促進動脈粥樣硬化發生發展的一個關鍵因素〔7，8〕。闡明血管平滑肌在病理性刺激中的增殖機制，對減緩動脈粥樣硬化的進程，預防和治療動脈粥樣硬化的發生發展可能起到積極的作用。

HH基因編碼一系列分泌型信號蛋白，在胚胎的發育過程中起著調控細胞增殖及組織分化的作用，在成熟器官中HH信號通路處于失活狀態。近年來研究發現，HH信號通路參與多種損傷后的組織修復過程，包括四肢、血管、前列腺、神經、膽管、肺以及骨骼〔4〕。但是，HH信號在不同組織中所起的作用是不一致的，認為HH信號的調節作用可能由于種屬、體內、體外以及環境的不同而有所不同〔9〕。此外，研究顯示，HH信號系統與多種疾病的發生、發展相關，在器官形態發育、調節細胞增殖中起重要的作用〔10〕。SHH信號通路在人類根據配體的不同分為3個亞型，即SHH信號通路、Indian hedgehog(IHH)信號通路及Desert hedgehog(DHH)信號通路〔11〕。該信號途徑是由SHH、2個跨膜受體Patched(Ptc)和Smoothed(Smo)組成的受體復合物、蛋白激酶A以及下游轉錄因子Gli家族(Glil、Gli2、Gli3)等組成，在進化上高度保守〔12〕。SHH信號通路在胚胎發育中的細胞生長分化、組織器官形成及成體干細胞的維持等方面具有重要的作用。已有研究發現，SHH信號通路參與調控VSMC和內皮細胞的分化，誘導肺血管形成，從而促進肺的發育成熟和器官形成〔13〕。此外，SHH通路啟動因子重組SHH可促進海水浸泡血管內皮細胞增殖和抑制其凋亡，證實SHH信號通路通過作用血管內皮細胞而促進毛細血管的修復〔14〕。

Cyclopamine是從藜蘆屬植物內分離得到的一種異甾體類生物堿，通過對抗SHH信號通路中Smoothed(Smo)蛋白而特異性抑制 SHH信號通路〔15〕。MTT結果顯示，培養液中加入0.625、1.25和2.5μmol/L Cyclopamine后血管平滑肌增殖受到明顯抑制，Cyclopamine對血管平滑肌增殖的抑制作用呈濃度及時間依賴性。因此，SHH信號通路在血管平滑肌增殖過程中起著一定作用。流式細胞儀檢測結果顯示，在培養液中加入1.25和2.5μmol/L Cyclopamine后，VSMC中處于G0/G1期的比例升高，而處于S期和G2/M期的比例降低，從而導致PI降低和AI升高。因此，SHH信號通路在VSMC增殖和凋亡中發揮重要作用，但是其確切的機制尚需作進一步研究。

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