MicroRNA－144在結腸癌中的表達水平及臨床意義

張廣鈺，鐘 漓，田小林，戴 凌，朱襲嘉，蔣志慶

（桂林醫學院附屬醫院胃腸外科，廣西 桂林 541001）

結腸癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤，其發生、發展是多基因相關、多步驟的，尋找結腸癌發生、發展的誘導和促進基因，為結腸癌的診斷、治療及其預后提供理論支持［1］。成為關注熱點的microRNA作為一種非編碼小分子RNA，具有廣泛調節基因表達的功能，參與細胞增殖、分化、凋亡等多種重要細胞活動的調控［2］。近年來，研究發現microRNA具有癌基因和抑癌基因的作用，從而參與腫瘤的發生、發展［3－4］。本文通過逆轉錄實時熒光定量聚合酶鏈反應（real－time reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－qPCR）檢測38例結腸癌中microRNA－144的表達水平，探討其與結腸癌及其臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 桂林醫學院2011年6月至2012年4月實施手術治療的結腸癌患者38例，其中，男21例，女17例，患者中位年齡59歲，術前未行放、化療等治療，組織病理類型的判斷標準參照WHO病理分期標準。每例標本留取腫瘤組織及對應7cm以上的癌旁正常結腸黏膜組織，每例都經病理切片檢查證實，離體后5min內置于液氮中保存。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、Oligo dT、dNTPs、SYBR Mastermix等購自Takara公司；引物由上海Invitrogen生物技術有限公司合成。

1.2 RNA提取 取液氮保存的結腸癌組織及癌旁正常結腸黏膜組織標本，在液氮中碾碎至粉末，加1mL Trizol裂解10 min收集上清液于EP管中，加氯仿200μL充分混勻，12 000 r／min離心15min，取上清200μL轉移到新的去RNA酶的EP管中，加等量異丙醇顛倒混勻放置10min，12 000r／min離心10min，棄上清液加1mL 70%的乙醇顛倒混勻，12 000r／min離心10min，棄去乙醇，干燥，用DEPC處理過的蒸餾水溶解。采用日本Malcom極微量光譜光度計e－spect測所提RNA濃度，OD 260／280在1.8～2.0之間的用于檢測。

1.3 RT－qPCR體系及其反應條件 表1為所用逆轉引物的序列。按所用逆轉錄試劑盒說明書20μL的體系，1μg RNA模板分別以microRNA－144和U6（作為內參，分析microRNA－144的表達）引物進行逆轉錄，反應條件：42℃60min。取樣進行qPCR，反應體系：1μL RT產物（終濃度為5ng）、2＊SYBR Green I Mastermix 12.5μL、0.5μmol／L microRNA 特異前向引物、0.5μmol／L通用的反向引物，所有樣品做3個復孔。反應條件：95℃7min后，95℃15s，60℃30s，40個循環。其余cDNA存放于－80℃超低溫冰箱。qPCR反應后隨即分別取6個樣品各1μL進行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測目標產物（圖1）。Real－time定量PCR使用的Agilent Technologies stratagene Mx3005p儀器。所得Ct值，以 U6為內參，用2－△△Ct進行分析來表示microRNA－144癌組織相對于癌旁正常組織的變化倍數。

表1 microRNA－144RT－qPCR檢測相關引物序列

圖1 qPCR產物電泳圖

1.4 統計學處理 microRNA的表達數據以中位數和95%可信區間（95%CI）表示。受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析采用SPSS13.0統計軟件行非參數秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 結腸癌及其相應癌旁正常結腸黏膜組織中的microRNA－144的表達情況 qPCR結果顯示，內參U6的Ct值沒有明顯變異，結腸癌組織中的microRNA－144的Ct值明顯低于相應的癌旁正常結腸黏膜組織，表明microRNA－144在結腸癌組織中表達上調。38例結腸癌患者癌組織與癌旁正常結腸黏膜組織的 microRNA－144的相對表達量 N（N＝2－△△Ct），差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 microRNA－144在結腸癌及癌旁組織中的表達情況

2.2 結腸癌組織中microRNA－144表達與臨床病理特征的關系 結腸癌組織中microRNA－144的表達與腫瘤的分化程度相關，高分化組的表達量低于中、低分化組的表達量（P＜0.05），中分化組表達量與低分化組的表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05）；結腸癌組織中 microRNA－144的表達水平與臨床TNM分期有顯著相關性（P＜0.05），Ⅰ～Ⅱ期結腸癌組織中microRNA－144表達量低于Ⅲ～Ⅳ期（P＜0.05）；結腸癌組織中microRNA－144的表達與淋巴結的轉移情況無相關性（P＞0.05）；結腸癌組織中 microRNA－144的相對表達量與其他臨床病理因素如性別、年齡、腫瘤的大小無明顯相關性（P＞0.05），見表3。

2.3 采用ROC曲線分析microRNA－144評價結腸癌細胞分化程度及TNM分期的特異性和敏感性 microRNA－144比較不同分化程度的ROC曲線下面積為0.800（95%CI＝0.661～0.939，P＝0.003），比較不同TNM分期的ROC曲線下面積為0.820（95%CI＝0.675～0.965，P＝0.001），提示 microRNA－144適合作為評價細胞分化程度和結腸癌TNM分期的判斷標準（圖2）。以microRNA－144相對表達量1.70作為評價臨界值，區分高分化結腸癌的敏感性和特異性分別為88.0%和61.5%，區分TNM分期的敏感性和特異性分別為87.5%和64.3%。

表3 結腸癌中microRNA－144表達和臨床病理因素的相關性

圖2 microRNA－144表達與結腸癌患者分化程度和TNM分期的ROC曲線

3 討 論

結腸癌是世界上第3大常見腫瘤，因結腸癌導致的死亡率排名第2位，約50%的結腸癌患者在確診時已發生遠處轉移，是一種惡性程度非常高的腫瘤，手術治療依然是結腸癌的主要治療方式之一。隨著使用抗EGFR和抗VEGF的分子靶向治療的應用及化療的進展，晚期結腸癌患者的中位生存期已經由6個月增高至2年［5］。隨著對結腸癌分子水平研究的深入，對microRNA在結腸癌的研究越來越多。

microRNA可調節30%的人類基因。成熟的microRNA一般有19～25個堿基，這些堿基與3′端非編碼區的mRNA（3′UTR）結合而抑制轉錄進而影響基因的表達［6］。目前，已有研究證實，microRNA通過參于基因調控影響蛋白表達水平而影響結腸癌的進展，而且，不同的microRNA在結腸癌的作用不同，甚至相同的microRNA在不同類型的結腸癌中的表達也不相同，有些microRNA充當癌基因作用，有些microRNA充當抑癌基因的作用［7］。microRNA在許多腫瘤中都發現有過表達，如乳腺癌、腦癌、肺癌、胰腺癌、甲狀腺癌等［7］。microRNA－144在結腸癌患者的糞便和血液中高表達［8－9］，然而其在結腸癌患者組織中的表達情況國內外尚沒有文獻報道，因此本課題選microRNA－144作為研究對象。本研究顯示，microRNA－144在結腸癌組織中的表達量明顯增高，在分析microRNA－144表達與結腸癌臨床病理因素的相關性中發現，microRNA－144表達水平與結腸癌組織的分化程度相關，而且與結腸癌腫瘤患者的TNM分期相關。microRNA－144在中低分化組中的表達水平高于高分化組，提示microRNA－144主要在結腸癌的進展階段起作用，而在結腸癌的發生起始階段可能以其他因素起作用為主。進一步的ROC曲線分析顯示，microRNA－144高分化結腸癌的敏感性和特異性分別為88%和61.5%（圖2）。因此，microRNA－144可以作為結腸癌腫瘤分化程度的一個輔助診斷標準。

microRNA－144可作為結腸癌腫瘤分化程度的一種輔助指標，其表達量的上調在診斷結腸癌的分化程度方面有較高的敏感性。本研究與大部分研究結果一致，目前發現有35種microRNA在結腸癌中有表達量的改變。然而，對于microRNA在腫瘤中的表達有一些截然不同的觀點，有些microRNA發現與分化程度呈正相關，而同樣關于該microRNA的研究則發現與分化程度呈負相關，有學者認為這主要是因為在體內的位置不同所致，也有研究發現在不同位置很少同時檢測到microRNA升高［9］。本研究表明，不同的分化程度、不同的臨床TNM分期均對microRNA－144產生影響。

本實驗結果顯示，microRNA－144在結腸癌組織中的表達量高于正常的結腸癌組織中的表達量，且隨著TNM分期而發生改變，提示microRNA可作為一種腫瘤的進展指標。有學者曾作過該方面的研究，其機制為microRNA導致腫瘤癌基因或抑癌基因發生了轉化［10］。但本研究對腫瘤的進展未作進一步深入研究。對microRNA作為一種臨床治療效果預測的分子標志，有許多研究曾報道［11］。本研究組目前對microRNA－144過表達患者的臨床治療效果以及預后情況正在作進一步研究。

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